分子生物学实验五.ppt

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1、分子生物学实验分子生物学实验实验五实验五 核酸的琼脂糖凝胶电泳核酸的琼脂糖凝胶电泳1 1、实验目的：、实验目的：学习与掌握学习与掌握DNADNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小的纯度、含量以及分子量，及分离不同大小的DNADNA片段。片段。2 2、实验原理：、实验原理：电泳概念及种类电泳概念及种类*影响琼脂糖电泳迁移的主要因素影响琼脂糖电泳迁移的主要因素*电泳概念电泳概念电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。带负电

2、粒带负电粒子子带正电粒带正电粒子子正正 极极负负 极极 颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。影响琼脂糖电泳迁移的因素影响琼脂糖电泳迁移的因素主要因素主要因素nDNADNA的大小的大小nDNADNA的构象的构象n琼脂糖浓度琼脂糖浓度n缓冲液缓冲液外界因素外界因素电场强度电场强度溶液的溶液的pHpH值值溶液的离子强度溶液的离子强度温度的影响温度的影响支持物的影响支持物的影响 凝胶中的琼脂糖含量凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）线状线状DNA分子的有效分离范围

3、（分子的有效分离范围（kb）0.3 56 0.6 120 0.7 0.810 0.9 0.57 1.2 0.46 1.5 0.23 2.0 0.12分离不同大小分离不同大小DNADNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度片段的合适琼脂糖凝胶浓度 对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。缓

4、冲液nTAETAE：乙酸盐缓冲液nTBETBE：硼酸盐缓冲液nTPETPE：磷酸盐缓冲液电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等一次性塑料手套等3.3.实验器材实验器材1)DNA1)DNA的准备的准备基因组基因组DNADNA质粒质粒DNA DNA DNADNA片断片断4.4.实验方法和步骤实验方法和步骤 2)2)琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶液的制备：称取琼脂糖凝胶液的制备：称取0.7g0.7g琼脂糖，置于三角瓶中。琼脂糖，置于三角瓶中。加入加入100ml TBE100ml TBE或或TAETAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等

5、，将该三工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。角瓶置于微波炉加直至琼脂溶解。3 3）胶板的制备）胶板的制备 取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约宽约1cm)1cm)，将有机玻璃内槽置于，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至将冷却至6565左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻上，控制灌胶速度和量，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。璃板表面形成均匀的胶层。室

6、温下静置室温下静置30min30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有玻璃内槽放在含有0.5-1TAE0.5-1TAE（Tris-Tris-乙酸）乙酸）或或TBETBE（Tris-Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。硼酸）工作液的电泳槽中使用。4 4）加样）加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿品，换

7、一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约透凝胶底部，本实验样品孔容量约151520 20 l l。n 1 kb DNA ladder 1 kb DNA ladder（markermarker）:在第一个上样孔或最后一个上样在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入孔内加入6 6 l l 的的 1 kb DNA ladder 1 kb DNA ladder（1010n ng/g/l l）。）。5 5）电泳（带上手套操作）电泳（带上手套操作）加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在建议在8080100V100V的电压下电泳；的电

8、压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm1cm处停止电泳；处停止电泳；将凝胶放入将凝胶放入溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB工作液（工作液（0.50.5 g/mlg/ml左右）中染色约左右）中染色约20min20min。为了获得电泳分离为了获得电泳分离DNADNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%0

9、.5%时，由于胶太稀，最好在时，由于胶太稀，最好在44进行电泳以增加凝胶硬度。进行电泳以增加凝胶硬度。6 6）观察与拍照）观察与拍照 在紫外灯在紫外灯(310nm(310nm波长波长)下观察染色后的凝胶。下观察染色后的凝胶。DNADNA存在处显示出存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发红色的荧光条带。紫外光激发30s30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采

10、用快速凝胶成象系统。Transport proteins and salt tolerance in plantsPlant Science 164(2003)891_/900 M.M.F.Mansour,K.H.A.Salama,M.M.Al-Mutawa Evidence indicates that plant salt tolerance operates at a cellular level.Commonly proposed cellular mechanisms include ion sequestration in vacuoles or ion exclusion at

11、plasma membranes.Plasma membrane ATPase and vacuolar ATPase and pyrophosphatase are proton pumps that provide an energy source for transport of ions across the plasma membrane and tonoplast,respectively.Membrane Na+/H+antiporters take advantage of the proton gradient formed by these pumps to exchang

12、e Na+/for H+across a membrane.Therefore,activity and expression of these proton pumps and Na+/H+antiporters are investigated in numerous plant species under saline environment.In this review,information is presented on responses of tonoplast and plasma membrane ATPases and Na+/H+antiporters to salin

13、ity.Inconsistencies exist in some of the information and this may be due to differences in cultivars,experimental conditions,salt level used and plant age.Correlation between increased activity and expression of these transport proteins and adaptation to salinity is proposed,although this correlation is based on untested hypotheses.This precludes a general conclusion to be drawn concerning the involvement of membrane transport systems in plant salt tolerance.It is obvious that further extensive studies are needed in this area.