细胞培养技术讲座(2).pdf

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1、研究生实验技术系列讲座(一)细胞培养技术（二）Cell Culture季明春2008-11-30细胞培养技术Cell Culture 一、细胞培养基本条件一、细胞培养基本条件 二、细胞培养无菌操作基本技术二、细胞培养无菌操作基本技术 三、培养细胞的生物学特征三、培养细胞的生物学特征二、细胞培养无菌操作基本技术 1、工作环境及表面的处理 2、细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 3、培养液与培养细胞的处理（一）无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范，也会导致污染。因而，为在一切操作中最大

2、可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。1、培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。1、培养前准备 工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐物品伤人等。2、操作野消毒 无菌培养室定期要用1新洁尔灭拖洗地

3、面(拖布要专用)。必要时每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟。实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60 分钟灭菌，用1新洁尔灭（或75%酒精）擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。2、操作野消毒 在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用1新洁尔灭擦洗后置于台内同时紫外线消毒。3、洗手和着装 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可

4、穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。做原代培养需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。4、火焰消毒 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管接种环、接种针5、实验操作 无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品（如试管架、移液器或吸管头等）可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用1

5、新洁尔灭（或75%酒精擦）拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。5、实验操作 小心取出无菌实验用品，避免造成污染。小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。5、实验操作 进行培养细胞操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。6、工作环境的处理 定期检查下列项目：定期检查下列项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养

6、箱内的CO2浓度、温度，以及及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常；定期更换紫外灯管；定期更换洗手液；三、培养细胞的生物学特征三、培养细胞的生物学特征Hepatocytes（一）体外培养细胞的分型（一）体外培养细胞的分型 1、贴附型、贴附型 2、悬浮型2、悬浮型（一）体外培养细胞的分型（一）体外培养细胞的分型1、贴附型：、贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：（1）成纤维细胞型）成纤维细胞型（2）上皮型细胞）上皮型细胞（3）游走细胞型）游走细胞型（4）多型细胞型）多型细胞型（1）成纤维细胞型：（1）成纤维细胞型

7、：（1）成纤维细胞型：（1）成纤维细胞型：名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的细胞的细胞来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织，如：真正的成纤维细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，血管内皮细胞的组织，如：真正的成纤维细胞，心肌细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，血管内皮细胞形态：形态：似体内成纤维细胞的形态，似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起3个长短不等的突起，卵圆形核，卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片并

8、不紧靠连成片，细胞，细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动，单独行动，游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，常有几个成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起伸长的细胞突起（2）上皮型细胞：（2）上皮型细胞：上皮型细胞（2）上皮型细胞：（2）上皮型细胞：名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全相同，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层、内胚层细胞来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡如：皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞扁平上皮细胞扁平，不规则多角形不规则多角形，圆形核，圆形核生长特点：生

9、长特点：易相连易相连成片，成片，相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状生长铺石状生长时呈时呈膜状膜状移动，移动，很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动HeLa Cell CulturePhase ContrastDifferential Interference ContrastChinese Hamster Ovary Cell Culture人胃癌细胞株SGC7901人肝癌细胞株HepG2人肺癌细胞株 A-549人乳腺癌MCF-7细胞株人前列腺癌细胞株2、悬浮型：2、悬浮型：概念：概念：培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮

10、状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：来源：来自血，脾或骨髓的细胞，尤其是血液肿瘤细胞来自血，脾或骨髓的细胞，尤其是血液肿瘤细胞特点：特点：在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好细胞细胞圆形圆形，单个或小细胞团，单个或小细胞团优点：优点：生存空间大，生存空间大，提供数量大，传代方便提供数量大，传代方便(不需消化)，(不需消化)，易于收获，易于收获，可获得稳定状态可获得稳定状态缺点：缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)小鼠骨髓瘤细胞株小鼠骨髓瘤细胞株人白血病细胞株U937人白血病细胞株U937人白血病细胞株HL-60人白血病细

11、胞株K562（3）游走细胞型：（3）游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。（4）多型细胞型：（4）多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。Rattus norvegicus(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤（二）培养细胞的生长和增殖过程（二）培养细胞的生长和增殖过程（一）培养细胞生命期（一）培养细胞生命期

12、（Life Span of Culture Cells）是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。Primary human ovarian surface epithelium(OSE)morphologyA)Nest of OSE cells 4 days after initial plating.B)Monolayer of cobblestone OSE at passage 1.C)Stromal cell(s)contamination of OSE culture.D)Senescent OSE cells at passage 4.A=100X magnification,B-D

13、=200X.1原代培养（1原代培养（Primary Culture）期：）期：是从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。特点：特点：（1）初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能上较相似与体内原组织在形态结构和功能上较相似，是检测药物很好的实验对象。（2）细胞群是异质的细胞群是异质的（Heterogeneous），细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存能力差。（3）初代培养细胞多呈二倍体核型二倍体核型。在软琼脂培养基中

14、细胞克隆形成2传代期：2传代期：初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系（Cell Line）。特点：特点：（1）在全生命期中此期的持续时间最长持续时间最长。（2）在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。（3）一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。3衰退期：衰退

15、期：特点：特点：（1）细胞增殖很慢或不增殖；（2）细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡；（3）更易发生自发转化更易发生自发转化（Spontaneous Transformation）转化的标志的一是细胞可能获得永生性（Immortality），即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line）。（4）转化细胞核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性质非同一性状细胞永生性和恶性性质非同一性状。（二）培养细胞（二）培养细胞一代一代生存期生存期所谓细胞“一代”一词，与细胞倍增

16、一代非同一含义与细胞倍增一代非同一含义。系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段三个阶段：细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：（1）潜伏期（Latent Phase）（2）指数增生期（Logarithmic growth Phase）：一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。（0.1%0.5%）（3）停滞期（St

17、agnate Phase）1潜伏期（潜伏期（Latent Phase）：）：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。贴附是贴壁细胞生长增殖条件之一。影响细胞贴附的因素：支持物、一些特殊物质（如纤维连接素 Fibronectin、细胞膜蛋白）培养细胞培养细胞一代一代生存期生存期1潜伏期（潜伏期（Latent Phase）：）：原因:原因:操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏

18、附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤的分子被破坏，细胞受到损伤接种细胞:接种细胞:适应，恢复，积累适应，恢复，积累(代谢中间产物)(代谢中间产物)组织块:组织块:细胞迁移出细胞迁移出 一般经数小时-几天一般经数小时-几天过程:过程:游离游离:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形吸附吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏期潜伏期:基本无增殖,少见分裂相影响潜伏期长短的因素影响潜伏期长短的因素：1.1.细胞密度细胞密度接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长2.2.细胞类型细胞类型传代培养的细

19、胞的潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为6-24h;原代24-96h或更长单个细胞潜伏期短,细胞大团长,组织块更长连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短来源：来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长成体:长影响潜伏期长短的因素影响潜伏期长短的因素：3.细胞机能状态不良者慢4.培养条件培养液、pH、支持物不利:污染,有毒当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。2指数增生期指数增生期（Logarithmic growth Phase）：）：细胞增殖最旺盛的阶段。细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一

20、个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。2指数增生期指数增生期特点：特点：（1）是细胞（1）是细胞增生最活跃增生最活跃、活力最旺盛活力最旺盛的阶段；的阶段；（2）培养物中（2）培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体细胞数量呈指数增长,细胞群体均一，是理想的实验用细胞。均一，是理想的实验用细胞。接触抑制和密度抑制在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细

21、胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制接触抑制（Contact Inhibition）。（Contact Inhibition）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制密度抑制（Density Inhibition（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。2指数增生期指数增生期判断细胞生长的指标：判断细胞生长的指标：指数生长期内细胞分裂活动的程度指数生长期内细胞

22、分裂活动的程度(增殖活性增殖活性)可作为判断可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标细胞生长是否旺盛的重要指标（1）.有丝分裂指数有丝分裂指数(MI):指培养物中指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计统计时，每瓶至少需计数时，每瓶至少需计数1000个细胞。个细胞。一般细胞的MI约为一般细胞的MI约为0.10.5%；原代培养物的MI比继代原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。2指数增生期指数增生期判断细胞生长的指标：判断细胞生长的指标：（2）.细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间:

23、培养物中细胞数量翻倍的平均时间（3）.MTT法法：反映细胞内一种酶活性程度（4）.标记核苷酸标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：掺入量：反映DNA3停滞期停滞期（Stagnate Phase）细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通

24、过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。3停滞期停滞期（Stagnate Phase）特点特点(1)(1)细胞数量：细胞数量：细胞达饱和密度，出现密度抑制。停止生长原因:细胞数量多、生长地区占满、营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长。即使经常更换培养液，细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡。唯有进行传代方可缓解。(2)(2)细胞活动小细胞活动小(3)(3)生长组分下降生长组分下降:010%:010%(4)(4)及时传代：及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况传代传代（Passage或Subculture）（Passage或Subculture

25、）体内细胞生长在动态平衡环境中，而培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。细胞系或细胞株的命名HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的

26、鉴定、管理和使用ATCC入库细胞要求检测项目如下：1、培养简历：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等2、2、冻 存 液：冻 存 液：培养基和防冻液名称3、3、细胞活力：细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性4、4、培 养 液：培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量细胞系或株的鉴定、管理和使用细胞系或株的鉴定、管理和使用5、细胞形态：5、细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特6、6、核型：核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无7、7、无污染检测：无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等

27、8、物种检测：物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测9、免疫检测：免疫检测：一两种血清学检测10、细胞建立者：细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名（三）培养细胞的观察（三）培养细胞的观察 肉眼观察培养物颜色及混浊度肉眼观察培养物颜色及混浊度 倒置显微镜观察细胞生长状态倒置显微镜观察细胞生长状态细胞计数细胞计数 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞 Coulter计数仪：人工计数细胞计数细胞计数1、将血球计数板及盖片擦拭干净，

28、并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板的间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。细胞传代方法细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：(1)悬浮生长细胞传代(1)悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打

29、形成细胞悬液再传代。(2)半悬浮生长细胞传代(2)半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。(3)贴壁生长细胞传代(3)贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。细胞传代方法细胞传代方法 贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法 吸光培养瓶中的培养液 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）,静置2-10 min（显微镜下动态监测）。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。吸取适量细胞悬液，接种于新的培养瓶内。加适量新

30、鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。细胞活力监测细胞活力监测 1台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：（1）、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；（2）、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；（3）、吸取少许悬液滴于载玻片上，加上盖片；（4）、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。细胞活力监测细胞活力监测 2四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色

31、产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪570nm测定OD值；MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤药物敏感性实验等。细胞活力监测细胞活力监测2四唑盐（MTT）比色法操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后

32、，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。3、标记核苷酸3、标记核苷酸(3H-TdR)掺入法掺入法（四）细胞冻存和复苏（四）细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，

33、细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法细胞冻存方法 1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO。冻存液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)；3加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞复苏方法细胞复苏方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融

34、化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。（四）细胞培养的污染和检测（四）细胞培养的污染和检测 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、支原体和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等是主要的污染源污染源。严格的无菌操作技术、清洁的环境、品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。细菌和真菌的污染和检测细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法肉眼直接观察法培养检查法培养检查法显微镜观察法显微镜观察法常用抗生素用量和效应抗菌谱抗生素细菌真菌支原体常用浓度青霉素G+100IU/m

35、l链霉素G-100g/ml庆大霉素G+,G-200g/ml四环素G+,G-10g/ml 卡那霉素G+,G-50g/ml 两性霉素2 g/ml 制霉菌素25 g/ml 你发现存在哪些问题？应如何进行整改？讨论细胞培养室管理规程讨论细胞培养室管理规程讨论细胞培养室管理规程讨论细胞培养室管理规程细胞培养室管理规则细胞培养室管理规则 总体要求：经济、有序、高效、安全总体要求：经济、有序、高效、安全 1、准入制度：1、准入制度：(1）必须取得实验室相关实验技能考试合格方可进入细胞培养室；（2）在本室工作的实验人员应严格遵守本室工作守则，外来人员在进入细胞培养室工作前，必须接受相关培训；（3）没有经过培训

36、的人员不得单独进入细胞培养室工作；（4）进入细胞培养室后要保持安静，不得大声喧哗。细胞培养室管理规则细胞培养室管理规则 2、安全制度：2、安全制度：（1）细胞培养室内必须注意安全用电；（2）谨慎使用酒精灯，不能在有明火的情况下加、换酒精；（3）实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器（如CO2孵箱、超净台、离心机、紫外线灯等）要经常注意运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修；（4)离开细胞培养室必须断开必要的仪器电源；（5）对不符合细胞培养室安全规定的行为主动提出纠正，并报告主管老师。细胞培养室管理规则细胞培养室管理规则 3、卫生消毒制度：3、卫生消毒制度：（1）一般情况下细胞间每日

37、消毒一次（包括缓冲间），方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次。必要时每周用10乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟；（2）实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；（3）及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位置；（4）除实验必须的用品外，其它物品不得带入细胞培养室；（5）细胞培养室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用，不得随意转移地点，以便他人顺利使用；（6）细胞培养室实施值日生负责制，值班人员负责检查室内是否保持清洁整齐，督促违反规定者改正错误。细胞培养室管理规则细胞培养室管理规则 4、出入制度：4、出入制度：进出细胞培养室应依次序开关门依次序开关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。(1)、进入缓冲间必须更换指定拖鞋更换指定拖鞋；(2)、人流人流：打开细胞培养室外门，进入缓冲间，开灯，关闭细胞培养室外门,穿戴专用的洁净隔离衣、工作鞋帽、口罩等；新洁尔灭泡手1分钟，进入细胞培养操作室,关闭操作室外门。（3）、物流物流：物品进入细胞培养室时，应先将物品放入超净台，打开紫外灯照射分钟；操作前关闭紫外灯。