讲座——Zorbax柱技术.pdf

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1、Agilent Technologies1页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱2003年3月24日28日创新的Zorbax柱技术，应用和方法开发杭州 苏州 无锡Agilent Technologies2页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱1.LC色谱柱技术及ODS柱2.创新的Zorbax色谱柱及应用3.HPLC方法开发与优化创新的Zorbax柱技术，应用和方法开发Agilent Technologies3页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱3-1 LC色谱柱技术及

2、ODS柱分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用硅胶的正相模式用键合相的正相模式用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱离子对键合相的反相模式用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量2,000分子量2,000Agilent Technologies4页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱反相分配色谱极性:固定相 流动相固定相-极性流动相(己烷，庚烷)-非极

3、性极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%3-1 LC色谱柱技术及ODS柱正相&反相色谱Agilent Technologies5页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱硅胶基质-pH 28Al2O3.nH2O(n=13)-pH114聚合物基质-pH114碱性环境硅胶溶解化学修饰困难刚性不够，孔结构复杂3-1 LC色谱柱技术及ODS柱柱填料基质Agilent Technologies6页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱Rx-SIL(硅溶胶)干凝胶结构:均一的胶层颗粒“海绵状”聚合物网状结构含孔率(%):表面

4、积(M2/G):强度:高pH承受能力:纯度:孔尺寸分类:50100/150高好高窄孔70100/300弱不好低-高大孔3-1 LC色谱柱技术及ODS柱硅胶对比Agilent Technologies7页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱ZORBAX生产工艺多孔二氧化硅微球粒径ZORBAX Rx3.5 m-or-5 m-or-7 m硅胶+脲(pH=2)+甲醛CH2O安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术孔?O2250oCStableBond,300SBEclipse XDBBonus-RPExtend,300Extend3-1 LC色谱柱技术及ODS柱Z

5、orbax 生产工艺Agilent Technologies8页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱固定相键合二甲基硅烷3-1 LC色谱柱技术及ODS柱传统的键合技术和封端封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)Agilent Technologies9页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱取代基：五个旁侧基团:异丙基Zorba

6、x StableBond 空间位阻保护-抗水解能力键合相流失,保留减弱另一个裸露的硅羟基，潜在的拖尾因素普通硅胶柱低 pH pH 1*未-封端:选择性,柱寿命*专利技术的空间位阻保护键合*5种选择性-C18,C8,CN,苯基,C3*适用于低pH样品ORRSiOHSiOSiRRROOHRZorbax StableBondC-18 pH：18 温度：900C碳覆盖率：10%表面积：180m2/g 粒径：3.5,5,7m孔径：80 键合试剂：C18封端：无3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX StableBondAgilent Technologies15页免费服务电话:800-820-

7、32782003-March Zobax 色谱柱卓越的低pH稳定性1.00.80.60.40.20.00 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000冲洗用流动相柱体积相对保留StableBond SB-C18(二异丁基-C18)ZORBAX Rx-C18(二甲基-C18)Competitor A-C18Competitor B-C18Competitor C-C18Competitor D-C18Competitor E-C18冲洗溶剂:50%甲醇/50%水1%TFA,90OC 溶质:甲苯3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX StableBon

8、dAgilent Technologies16页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱五种键合相选择色谱柱:4.6 x 250 mm,5 mm流动相:0-100%B in 18.8 minA:50 mM NaH2PO4,pH 2.5 in 95%H2O/5%ACNB:50 mM NaH2PO4,pH 2.5 in 47%H2O/53%ACN流速:1.5 mL/min温度:26CUV:254 nm样品:1.Procaine 普鲁卡因2.Lidocaine 利多卡因3.d-Cinchonine 金鸡宁4.Butacaine 布他卡因5.Tetracaine

9、丁卡因StableBondSB-C18StableBondSB-C8StableBondSB-PhenylStableBondSB-C3 StableBondSB-CN键合相不同，选择性与分辨率均不同11111333332222244444555550 5 10 15Time(min)3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX StableBondAgilent Technologies17页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱改善 Propranolol 萘心安峰形色谱柱:ODS 4.6 x 250 mm 5 um塔板数:92USP Tf(5%

10、):2.90色谱柱:SB-C184.6 x 150 mm 5 um塔板数:6371USP Tf(5%):1.09流动相:75%50 mM KH2PO425%ACN pH 4.4 流速:1.5 mL/min SB-C18 色谱柱上峰形优异05 10Time(min)Propranolol 萘心安OHOCH2CHCH2NHCH(CH3)205 10 15Time(min)3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX StableBondAgilent Technologies18页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱反相色谱柱Bonus-RP酰胺嵌入二

11、异丙基-C14三封端Bonus-RP酰胺嵌入二异丙基-C14三封端Eclipse XDB二甲基键合双封端Eclipse XDB二甲基键合双封端Extend-C18双齿键合-C18双封端Extend-C18双齿键合-C18双封端SB-C18二异丁基-C18Eclipse XDB-C18Eclipse XDB-C8Eclipse XDB-苯基StableBond二异丙基二异丁基键合StableBond二异丙基二异丁基键合Rx/SB-C8二异丙基-C8SB-苯基二异丙基-苯基SB-AQ二异丙基SB-CN二异丙基-CNSB-C3三异丙基Rx-C18二甲基十八烷基硅烷Rx-C18二甲基十八烷基硅烷3-2

12、创新的Zorbax色谱柱及应用四项Zorbax创新的键合技术Agilent Technologies19页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱*改善碱性化合物色谱峰峰形 中等pH*适用于各种样品类型 酸性,碱性,中性*pH适用范围广:pH 2-9*双封端-两种不同的封端试剂进行更加完全的硅羟基覆盖CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333Zorbax Eclipse XDBC-18pH：29 温度：600C碳覆盖率：10%表面积：180m2/g 粒径：3.5,5m孔径：80 键合试剂：C18封

13、端：双3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technologies20页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱pH 8时柱寿命优异色谱柱:Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm流动相:55%10 mM 硼酸盐,pH 8.25:45%ACN 流速:1.0 mL/min 温度:RT 七个月的使用，保留时间仅仅有略微改变0 months2 months7 months10 1 2 3 4 5 6 7 8 9Time(min)2345样品:1.Uracil 尿嘧啶2.Bromazepa

14、m 溴西泮3.Oxazepam 奥沙西泮4.Lorazepam 劳拉西泮5.Clobazam 氯巴占6.Diazepam 安定3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technologies21页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱卓越的重现性Lot 1 Lot 2 Lot 3%RSDLot 1Lot 2 Lot 3%RSD1.51 1.48 1.423.1-4.08 4.02 3.882.62.702.722.730.568.17 8.04 7.742.82.002.001.990.2914.02 13

15、.92 13.39 2.51.72 1.721.730.34Retention,k?Selectivity,?Lot 1 Lot 2 Lot 3%RSDLot 1Lot 2 Lot 3%RSD0.80 0.88 0.885.4-1.96 2.14 2.155.12.452.432.440.413.83 4.15 4.164.61.961.941.940.596.26 6.79 6.844.81.641.641.640.00Retention,k?Selectivity,?pH 3pH 70 5 10 15 201Time(min)0 5 10Time(min)2341234色谱柱:Eclips

16、e XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:85%25 mM 磷酸:15%ACN 流速:1.0 mL/min 温度:35C1.Cefotaxime 头孢噻肟2.Cefoxitin 头孢西丁3.Cefamandole 头孢羟卞唑4.Cephalothin 头孢噻吩3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technologies22页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱与ZORBAX StableBond不同的选择性Eclipse XDB-C8色谱柱:4.6 x 75 mm,3.5 mm 流

17、动相:80%25 mM NaH2PO4,pH 3.0:20%MeOH 流速:1.0 mL/min温度:35C 检测器:UV 254 nm 不同键合技术提供不同选择性，以提高样品分辨率SB-C80 5 10321Time(min)0 5 10 152,31Time(min)样品:1.Barbital 巴比妥 巴比妥2.Sulfamethoxazole 新诺明3.Caffeine 咖啡因3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technologies23页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱pH 7 时，带酸

18、性与碱性基团的Cephalosporins 头孢菌素峰形较佳色谱柱:Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm,5 mm流动相:85%25 mM Na2HPO4,pH 715%ACN 流速:1.0 mL/min 温度:40C样品:Cephalosporins头孢菌素1.Ceftazidime 头孢他啶2.Cefaclor 头孢克洛3.Cefotaxime 头孢噻肟4.Cefoxitin 头孢西丁5.Cephalothin 头孢噻吩0 5 10 15 20 213Time(min)543-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technol

19、ogies24页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱碱性组分峰形较佳色谱柱:Eclipse XDB-C8,4.6 x 250 mm,5 mm流动相:40%25 mM 磷酸缓冲液,pH 7.0:60%ACN流速:1.5 mL/min温度:40C样品:TricyclicAntidepressants 三环抗抑郁药1.Desipramine 地昔帕明2.Nortriptyline 去甲替林3.Doxepin 多塞平4.Imipramine 米帕明5.Amitriptyline 阿米替林6.Trimipramine 三甲丙咪嗪0.0 2.5 5.0123456

20、Time(min)3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Eclipse XDBAgilent Technologies25页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱反相色谱柱Bonus-RP酰胺嵌入二异丙基-C14三封端Bonus-RP酰胺嵌入二异丙基-C14三封端Eclipse XDB二甲基键合双封端Eclipse XDB二甲基键合双封端Extend-C18双齿键合-C18双封端Extend-C18双齿键合-C18双封端SB-C18二异丁基-C18Eclipse XDB-C18Eclipse XDB-C8Eclipse XDB-苯基Stabl

21、eBond二异丙基二异丁基键合StableBond二异丙基二异丁基键合Rx/SB-C8二异丙基-C8SB-苯基二异丙基-苯基SB-AQ二异丙基SB-CN二异丙基-CNSB-C3三异丙基Rx-C18二甲基十八烷基硅烷Rx-C18二甲基十八烷基硅烷3-2创新的Zorbax色谱柱及应用四项Zorbax创新的键合技术Agilent Technologies26页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱*碱性化合物色谱峰峰形良好*极性烷基酰胺键合相*独特的选择性*空间位阻保护键合相和三封端增强低 pH 稳定性ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1C

22、H3R1R1R1CH3R1SiSiPGPGPGZorbax Bonus-RPC-18pH：29 温度：7,400C;pH 7,600C 碳覆盖率：12%表面积：180m2/g 粒径：3.5,5m孔径：80 键合试剂：双齿 C18封端：双3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies34页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱高pH下的反相 HPLC*增加游离碱性化合物在反相固定相上的保留*改善选择性*扩充LC/MS的使用范围*改善样品溶解度*对部分化合物进行离子交换3-2创新的Zorbax色

23、谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies35页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱高pH下，键合相稳定性硅胶溶解量mg色谱柱:4.6 x 150 mm,5 mm冲洗:50%ACN/50%0.02 M 磷酸钾缓冲液pH 11流速:1.5 mL/min温度:25C检测:钼酸硅显色反应测硅酸盐浓度淋洗液体积 LEclipse XDB-C8Eclipse XDB-C18Extend C180 2 4 6 8 10 12 14 161801601401201008060402003-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZO

24、RBAX Extend-C18Agilent Technologies36页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱高pH下，Extend-C18 可改善碱性成分峰形*高pH下，碱性成分的保留增加色谱柱:ZORBAX Extend-C18,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:30%缓冲液:70%MeOH pH 7 缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液 20 mM TEA 流速:1.0 mL/min 温度:RT检测器:UV 254 nmExtend-C18pH 110 512,345Time(min)76Extend-C18pH 7tR

25、=8.50 5 101234Time(min)657tR=11.4样品:1.Maleate 马来酸盐2.Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3.PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4.Doxylamine 抗敏安(多西拉敏)pKa 9.2 5.Chlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6.Triprolidine 苯丙烯啶pKa 6.5 7.Diphenhydramine苯海拉明 pKa 9.03-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies37页免费服务电话:800-820-32

26、782003-March Zobax 色谱柱高pH下分析金丝桃素色谱柱:ZORBAX Extend-C18,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:10%20 mM TEA,pH 11:90%MeOH 流速:1.5 mL/min 温度:30C 检测器:UV 254 nm Hypericin 金丝桃素在碱性溶液和有机碱中溶解性最好 高pH下Hypericin 金丝桃素的灵敏度提高了两倍Hypericin 金丝桃素pH 7制备样品Hypericin 金丝桃素pH 11制备样品0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.04.5 5.0 Time(min)1050MAU1

27、050MAU0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.04.5 5.0 Time(min)3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies38页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱0.0 2.5 Time(min)0.0 2.5Time(min)高pH下分析苯酚SB-C8Extend-C18流动相:35%10 mM NH4OH/NaOH,pH 11:65%MeOH流动相:20%H2O:80%MeOH流速:1.0 mL/min检测器:UV 254 nm温度:RTN=1

28、3279N=13831可使用氨流动相进行高效分析在LC/MS上使用时，兼容性，灵敏度高ESI/MS中，苯酚可电离Phenol pKa=9.53-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies39页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱高pH改善柱效和峰形-普鲁卡因酰胺样品:1.Procainamide 普鲁卡因酰胺2.2.N-AcetylProcainamide N-乙酰基普鲁卡因酰胺3.3.N-propionylProcainamide N-丙酰基普鲁卡因酰胺50%20 mMTEA,pH 11

29、:50%MeOH50%25 mMNa2HPO4,pH 7.0:50%MeOH塔板数1.49032.76213.75670.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 213Time(min)塔板数1.94752.88233.87940.0 2.5 5.0 7.5 213Time(min)色谱柱:ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm,5 mm 流动相:See Above 流速:1.0 mL/min 检测器:UV 254 nm 温度:RT3-2创新的Zorbax色谱柱及应用ZORBAX Extend-C18Agilent Technologies40页免费服务

30、电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱键合相-适用pH范围StableBond,pH 1-61.使用空间位阻大的硅烷2.未-封端Eclipse XDB,pH 2-91.致密键合的二甲基烷基硅烷2.专利技术双-封端Bonus-RP,pH 2-81.极性烷基固定相2.使用空间位阻大的硅烷3.三封端Extend-C18,pH 2-11.51.独特的双齿键合结构2.双封端SiOSiOSilica SupportC18C18SiONHOSilica-based 色谱柱Packing with Alkyl/amide Stationary PhaseORRSiOHSiOSi

31、RRROOHRCHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333ORSiSiOSiORR1CH3CH3CH3CH3RR1CH3R1R1R1CH3R11 1SiSiPGPGPGR 1R 13-2创新的Zorbax色谱柱及应用四项Zorbax创新的键合技术Agilent Technologies41页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱尝试Bonus-RP碱性物质保留不当当碱性物质色谱峰峰形是首要考虑因素时?在pH 6-8使用时，色谱峰峰形较好低 pH 下，柱寿命长，色谱峰峰形好StableBondEcl

32、ipse XDB高 pH 下尝试Extend 适用于低有机相 可用于100%水相3-2创新的Zorbax色谱柱及应用四项Zorbax创新的键合技术Agilent Technologies42页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱Zorbax 产品的具体应用*常规小分子分离StableBond,Eclipse XDB,Bonus-RP,Extend*亲水化合物分离(用于 100%含水流动相的反相色谱柱)SB-Aq(低 pH)Bonus-RP(中 pH)*疏水化合物分离StableBond色谱柱(低 pH,高温)Extend-C18(高 pH,室温)*碳水

33、化合物分析Zorbax 碳水化合物分析色谱柱*手性分离Chiradex 色谱柱Ultron ES-OVM Ultron ES-胃蛋白酶色谱柱*肽或蛋白质分离300SB和300Extend(80 A 固定相也可用于肽的分离)GF-系列尺寸排阻色谱柱Eclipse AAA 色谱柱(氨基酸分析)最新!Poroshell 300SB-C18,C8 和 C3 蛋白质分析柱*双链DNA分离Eclipse 双链DNA分析色谱柱*寡核苷酸分离Zorbax Oligo 色谱柱(IEX/RP 色谱柱)300Extend-C183-2创新的Zorbax色谱柱及应用四项Zorbax创新的键合技术Agilent Tec

34、hnologies43页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱1.LC色谱柱技术及ODS柱2.创新的Zorbax色谱柱及应用3.HPLC方法开发与优化创新的Zorbax柱技术，应用和方法开发Agilent Technologies44页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱改善色谱峰峰形的HPLC方法优化*选用完全羟基化的高纯硅胶基质的色谱柱Zorbax Rx-Sil 色谱柱：StableBond,Eclipse XDB,Bonus-RP和Extend*针对中等pH或复杂碱性样品，选用双封端色谱柱：Eclipse

35、XDB*针对中等或高pH，选用特殊 键合相以改善色谱峰峰形：Bonus-RP,Extend*针对大分子量组份，选用大孔径色谱柱*尽可能使用低pH缓冲液以减少二次作用*在不同pH范围下，均使用25 50 mM缓冲液*注意选择溶解样品的溶剂3-3 HPLC方法开发与优化建议Agilent Technologies45页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱pH 1-3 时碱性组分峰形较好，方法重现性好非-极性极性可电离萘苯甲醇苯甲酸苊硝基苯苯甲酰基苯胺pH 3pH 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

36、1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Time(min)Time(min)Time(min)3-3 HPLC方法开发与优化样品与pH值大部分样品可电离Agilent Technologies46页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱样品的pKa与pH对峰形的影响色谱柱:ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:40%5 mM KH2PO4:60%ACN 流速:1.0 mL/min.温度:RT0 1 2 3 4 5 6 7 8

37、9 100 1 2 3 4 5 6 7 89 10Time(min)Time(min)pH 4.4pH 3.0Ibuprofen异丁苯丙酸pKa=4.4CH3CHCOOHCH2CH(CH3)2尽量避免使用与待测物的pKa相近的流动相，否则可能出现不一致的拖尾峰3-3 HPLC方法开发与优化样品与pH值Agilent Technologies47页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱低pH下碱性组分峰形较佳色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm,5 mm流动相:85%25 mM Na2HPO415%ACN流速:1.0

38、mL/min.温度:35 CUSP TF(5%)4.1.33pH 3.0pH 7.0USP TF(5%)4.2.35Time(min)0 2.5 5.012345Time(min)0.02.55.035421在低pH下，硅胶硅羟基上的质子化后，碱性组分峰形较佳样品:Amphetamine 苯丙胺1.Phenylpropanolamine 去甲麻黄碱pKa 9.42.Ephedrine麻黄素pKa 9.63.Amphetamine苯丙胺pKa 9.94.MethAmphetamine脱氧麻黄碱pKa 10.15.Phentermine苯丙胺pKa 10.13-3 HPLC方法开发与优化样品与pH

39、值Agilent Technologies48页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱改善色谱峰峰形的HPLC方法优化*选用完全羟基化的高纯硅胶基质的色谱柱Zorbax Rx-Sil 色谱柱：StableBond,Eclipse XDB,Bonus-RP和Extend*针对中等pH或复杂碱性样品，选用双封端色谱柱：Eclipse XDB*针对中等或高pH，选用特殊 键合相以改善色谱峰峰形：Bonus-RP,Extend*针对大分子量组份，选用大孔径色谱柱*尽可能使用低pH缓冲液以减少二次作用*在不同pH范围下，均使用25 50 mM缓冲液*注意选择溶解样

40、品的溶剂*避免样品过载*酸洗以改善色谱峰峰形3-3 HPLC方法开发与优化建议Agilent Technologies49页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱05 10 15Time(min)OCH3CHCH2NHCH(CH3)2OHRx-SIL硅胶基质的ZORBAX StableBond-有效改善色谱峰峰形硅胶类型 A 酸性更强色谱柱:ODS,4.6 x 250 mm,5?m理论塔板数:92USP Tf(5%):2.90Propranolol 萘心安 pKa 9.5硅胶类型 B高纯,Rx-Sil色谱柱:SB-C18,4.6 x 150 mm,5?m

41、理论塔板数:6371USP Tf(5%):1.09流动相:75%50 mM KH2PO4,pH 4.4:25%ACN 流速:1.5 mL/min高纯 Rx-SIL 基质的C18 色谱柱可有效的改善色谱峰峰形05 10Time(min)3-3 HPLC方法开发与优化硅胶基质Agilent Technologies50页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱二氧化硅NaKMgAlCaTiFeZrCuCrZnZorbax Rx-SIL10 341.52nd3ndndnd1Zorbax SIL17ndnd579322188 1nd88Nucleosil56N/A

42、 N/And1305776ndN/A N/AndHypersil2900 N/A403003865230 N/A N/A N/A N/And=未检出金属浓度（ppm)A类硅胶Original ZORBAX SIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAX Rx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾Zorbax Rx-SIL:11种金属 35 ppm(未检出其他杂质,1ppm);99.995%纯度的二氧化硅Type BType A3-3 HPLC方法开发与优化硅胶基质Agi

43、lent Technologies51页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱金属敖合反应导致色谱峰峰形不佳*待测组分与金属发生敖合反应导致色谱峰峰形不佳*金属络合物导致色谱峰前伸和拖尾*液相系统中金属来源：溶剂，管线，不锈钢过滤芯*高纯硅胶能消除硅胶上的金属来源3-3 HPLC方法开发与优化硅胶基质Agilent Technologies52页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱改善色谱峰峰形的HPLC方法优化*选用完全羟基化的高纯硅胶基质的色谱柱Zorbax Rx-Sil 色谱柱：StableBond,Ecl

44、ipse XDB,Bonus-RP和Extend*针对中等pH或复杂碱性样品，选用双封端色谱柱：Eclipse XDB*针对中等或高pH，选用特殊 键合相以改善色谱峰峰形：Bonus-RP,Extend*针对大分子量组份，选用大孔径色谱柱*尽可能使用低pH缓冲液以减少二次作用*在不同pH范围下，均使用25 50 mM缓冲液*注意选择溶解样品的溶剂*避免样品过载*酸洗以改善色谱峰峰形3-3 HPLC方法开发与优化建议Agilent Technologies53页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱pH 7双封端改善色谱峰峰形两支色谱柱均为高纯硅胶基质双封

45、端的色谱峰柱上硅羟基的二次作用减少，保留与拖尾都减少4色谱柱:4.6 x150 mm,5 mm 流动相:60%ACN:40%10 mM 磷酸盐缓冲液pH 7.0 流速:1.5 mL/min.温度:40 C单封端非Zorbax C18双封端Eclipse XDB-C80 1 2 3 4 5 6 7 8Time(min)12312340 1 2 3 4 5 6 7 8Time(min)Tf1.2.952.1.903.2.544.1.22Tf1.1.792.1.413.1.244.1.01样品:1.Nortriptyline 去甲替林 pKa 9.7 2.Doxepin 多塞平 pKa 9.0 3.

46、Amitriptyline 阿米替林 pKa 9.44.Trimipramine 三甲丙咪嗪3-3 HPLC方法开发与优化双封端Agilent Technologies54页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱改善色谱峰峰形的HPLC方法优化*选用完全羟基化的高纯硅胶基质的色谱柱Zorbax Rx-Sil 色谱柱：StableBond,Eclipse XDB,Bonus-RP和Extend*针对中等pH或复杂碱性样品，选用双封端色谱柱：Eclipse XDB*针对中等或高pH，选用特殊 键合相以改善色谱峰峰形：Bonus-RP,Extend*针对大分子

47、量组份，选用大孔径色谱柱*尽可能使用低pH缓冲液以减少二次作用*在不同pH范围下，均使用25 50 mM缓冲液*注意选择溶解样品的溶剂*避免样品过载*酸洗以改善色谱峰峰形3-3 HPLC方法开发与优化建议Agilent Technologies55页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱大分子需要大孔径填料以改善色谱峰峰形*大孔径300全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽分子量虽小但hydrodynamic volume（水动力学体积）较大的分子*Poroshell 色谱柱高流速下，高柱效分析大分子的蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出键合

48、相孔，与孔内表面的键合相进行反应3-3 HPLC方法开发与优化大孔径Agilent Technologies56页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300)SB-C18(80)PW 1/2Leu EnkephalinM.W.=556AngiotensinII（血管紧张素II）M.W.=1046Insulin BM.W.=3,496Cyt CM.W.=12,327Rnase（核糖核酸酶）M.W.=13,684Lysozyme（溶菌酶）M.W.=13,9

49、00300色谱柱改善蛋白质和多肽峰形对大分子分析选择相应孔径的填料可获得最佳峰形孔径，分子尺寸对峰宽的影响（梯度分离）3-3 HPLC方法开发与优化大孔径Agilent Technologies57页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱300色谱柱可改善大分子的峰形色谱柱:4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:60%MeOH:40%0.1%TFA 流速:0.75 mL/min 温度:RT检测器:UV 282 nm 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径 窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3 (80)300SB-C3 (300)Pw1

50、/2=0.442Pw1/2=0.125 OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0 5 10Time(min)0 5 10Time(min)Tylosin（泰乐菌素）MW.926分子量虽小但 hydrodynamic volume（水动力学体积）较大的分子3-3 HPLC方法开发与优化大孔径Agilent Technologies58页免费服务电话:800-820-32782003-March Zobax 色谱柱多孔外壳实心核?mPoroshell填料颗粒高效分离蛋白质和多肽*Poroshell 30