11《DNA重组技术的基本工具》.ppt

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1、基因工程基因工程专题专题1烟草烟草据据据据WTOWTOWTOWTO调查：调查：调查：调查：20042004年全世界年全世界年全世界年全世界因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约因狂犬病致死人数约5.55.5万人万人万人万人中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：中国卫生部通报：20042004年年年年月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。死亡数之首。发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近发病死亡率近100%100%能产生狂犬病抗体能产生狂犬病抗体蛋白的转基因蛋白的转基因每

2、每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取猪或牛的胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将年，美国将人的胰岛素基因人的胰岛素基因重组到重组到大肠杆菌大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药治疗糖尿病特效药 据据WTO调查：调查：2005年全世界约有糖尿病患者年全世界约有糖尿病患者1.8亿亿人，我国约人，我国约6000万。万。胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素基因工程的别名操作环境操作对象操作水平主要的技术结果DNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNA分子水平分子水平人类需要的新生物类型和产品人类需要的新生物类型和产品一一 基

3、因工程的原理基因工程的原理DNA重组技术和转基因技术重组技术和转基因技术问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌毒蛋白毒蛋白毒蛋白毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉普通棉花抗虫棉解决培育抗虫棉的关键步骤解决培育抗虫棉的关键步骤“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“缝合缝合”

4、关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的基因进入受体细胞的载体载体二、二、DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具需要哪些工具？需要哪些工具？思考思考在自然界中有一些生物的在自然界中有一些生物的DNADNA可能进入另一种可能进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例生物的细胞中。我们有没有学过相关的实例？细菌为什么不会因外源细菌为什么不会因外源DNADNA的入侵而灭绝？的入侵而灭绝？(1)(1)来源：来源：(2)(2)特点：特点：具有专一性具有专一性表现在表现在:1、

5、识别双链识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列分子中特定的核苷酸序列,2、切割特定核苷酸序列中的特定位点切割特定核苷酸序列中的特定位点(3)(3)作用实质作用实质 使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键断开（断开（切割切割DNA分子）分子）（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶-“分子手术分子手术刀刀”T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 AG A A T T CC T T A A G C C C G G GG G G C C CEcoR（4）作用结果：作用结果：黏性末端和平末端黏性末端和平末端SmaEcoR 黏性末端黏性末端

6、黏性末端黏性末端Sma 平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？思考思考实例 1：1、下列关于限制酶的说法正确的是（、下列关于限制酶的说法正确的是（）A.限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端后都会形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键限制酶的作用部位是特定

7、核苷酸形成的氢键要想获得某个特定性状的基因必须要用限制要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶用同一种限制酶来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两，然后让两者的黏性者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就起来，就似乎似乎可以合可以合成重组的成重组的DNA分子了。分子了。（二）（二）“分子缝合针分子缝合针”DNA连接酶连接酶作用作用:把切

8、下来的把切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA，即将即将脱氧核糖和磷酸脱氧核糖和磷酸连接起来连接起来.作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成类型：类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效

9、率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别 可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶连接酶连接酶或或或或T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶即即即即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 T4 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，但效率较低起来，但效率较低T T4 4DNADNA

10、连接酶连接酶连接酶连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别区别相同点相同点寻根问底寻根问底DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?1)1)只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连连接到已有的接到已有的DNADNA片段上，片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键形成形成磷酸二酯键磷酸二酯键1)1)在在两个两个DNADNA片段之片段之间间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键(三三)“)“分子运输车分子运输车”基因进入受体细胞的载基因进入受体细胞的载体体载体需要的条件：有1多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选 常用运载体：细菌的质粒 噬菌体

11、 (3)某些动植物病毒假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？录，转基因生物能有预想的效果吗？作为分子运输车作为分子运输车载体，如果没有切割位点将载体，如果没有切割位点将会怎样？会怎样？霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？子运输车吗？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？运载体运载体运载体运载体：常用：常用质粒质粒质粒质粒质粒特点：质粒特点：质粒特点：质粒特点：1、细菌、细菌染色体染色体外双链环状外双链环状DNA分子分

12、子2、能自我复制并在受体细胞中稳定、能自我复制并在受体细胞中稳定存在存在3、有一个或多个限制酶切点、有一个或多个限制酶切点4、有特殊的遗传标记基因、有特殊的遗传标记基因注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。总总结结基因工程基因工程的工具的工具限制限制 酶酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有专一性具有专一性(识别序列识别序列)切开切开DNA分子的磷酸二酯键分子的磷酸二酯键DNA连连接酶接酶连接磷酸二酯键连接磷酸二酯键 种类种类E.coliDNA连接酶连接酶T4 DNADNA连接酶连接酶运载运载工工 具具具备的具备的条件条件结构简单结构简单,大小适中大小适中能在宿主细胞中自能在宿主细胞中自我复制并稳定存在我复制并稳定存在具一个多个限制酶切位点具一个多个限制酶切位点具标记基因具标记基因质粒、质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒噬菌体衍生物、动植物病毒