食源性致病菌检验标准操作程序46337.pdf

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1、食源性致病菌检验标准操作程序 福建省疾病预防控制中心 二一二年十一月 一、生物样本检验标准操作程序（一）粪便样本的保存、运送和检测 表 1 粪便样本的保存、运送和检测培养条件 培养基 目标病原体 温度 细菌标本保存和运送 1.CaryBlair 所有食源性致病菌 室温 增菌液 1.改良磷酸盐缓冲液 小肠结肠炎耶尔森氏菌 4 2.mEC 增菌肉汤 EHEC O157:H7/STEC 37 3.Preston 肉汤 弯曲菌 微需氧 42 4.SBG 增菌液 沙门氏菌 37 5.3%氯化钠碱性蛋白胨水 弧菌 37 选择性分离平板 1.Mac 平板 EPEC、STEC、ETEC、EIEC、EAEC、志

2、贺氏菌 37 2.XLD 平板 志贺氏菌 37 3.mCCD 平板 弯曲菌 微需氧 42 4.耶尔森氏菌选择性平板 小肠结肠炎耶尔森氏菌 25 5.科玛嘉 O157:H7 显色平板 EHEC O157:H7 37 6.科玛嘉沙门氏菌显色平板 沙门氏菌 37 7.科玛嘉弧菌显色平板 TCBS 平板 弧菌 37 病毒标本 1.采便盒 轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒-20 以下（二）检验方法与流程（三）沙门氏菌和志贺氏菌检测操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella）的检验方法。2 检验程序 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序见图1

3、。图1 沙门氏菌和志贺氏菌检验程序 36 1，18 h24 h 粪便或肛拭子 挑取 3 个或以上可疑菌落，接种于 5羊血琼脂平板 报告 进行系统生化鉴定、血清学试验 TSI，赖氨酸，MIO，西蒙氏柠檬酸盐琼脂，尿素 SBG 增菌液 XLD 和 MAC 36 1，18 h24 h 36 1，18 h24 h 直接 科玛嘉沙门显色培养基 TSI:K/Ag+赖氨酸:+MIO:+/-/+柠檬酸盐:+尿素:-TSI:K/A tr 赖氨酸:+MIO:+/-/-柠檬酸盐:-尿素:-TSI:K/Ag 赖氨酸:-MIO:+/-/+柠檬酸盐:-尿素:-TSI:K/A 赖氨酸:-MIO:-/V/-柠檬酸盐:-尿素:

4、-反 应 结 果 与左 侧 描 述 不符 TSI:K/A 赖氨酸:-MIO:-/-/+柠檬酸盐:-尿素:-沙门氏菌属 伤寒沙门氏菌 甲型副伤寒沙门氏菌 志贺氏菌属 宋内志贺氏菌 可 能 是 肠 道菌群，或者需要 额 外 试 验以 排 除 其 他致 病 菌 或 生化 不 典 型 的沙 门 氏 菌 或志 贺 氏 菌 分离株 36 1，18 h24 h 3 操作步骤 3.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见

5、到粪便。所采集的标本尽快检验，放入 Cary-Blair 运送培养基中的标本应在冷藏条件下 24 h 内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下 8 h内送检。3.2 分离培养 3.2.1 直接分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在 XLD和 MAC 一区划线；以 1 L 无菌接种环或接种针划线分离。在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入 SBG 增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入 SBG 增菌液。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子：

6、轻搅混合标本；拭子在 XLD 和 MAC 一区划线；以 1 L 无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入 SBG 增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入SBG 增菌液。平板 36 1 培养 18 h24 h。3.2.2 增菌培养 增菌液于 36 1 培养 18 h24 h，采用上述方法于科玛嘉沙门氏菌显色平板上划线分离，36 1 培养 18 h24 h。3.3 菌落特征 3.3.1 选择性平板上可疑菌落的特征见表 1。表1 沙门氏菌属和志贺氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌（大多数）伤寒沙门氏菌 志贺氏

7、菌属 MAC 琼脂 菌落光滑、无色，直径 2 mm3 mm XLD 琼脂 菌落呈红色，直径 2 mm4 mm 科玛嘉显色培养基 紫色或酒红色 紫色或酒红色 3.4 纯培养 挑取 3 个或以上可疑菌落，划线接种 5%羊血琼脂平板，36 1 培养 18 h24 h。3.5 初步鉴定 可疑菌落接种 TSI 琼脂，赖氨酸脱羧酶培养基、动力-靛基质-鸟氨酸琼脂（MIO）、西蒙氏柠檬酸盐琼脂和尿素琼脂。沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别见表 2。表2 沙门氏菌属和志贺氏菌属生化反应初步鉴别表 项目 沙门氏菌（大多数）伤寒 沙门氏菌 甲型副伤寒 沙门氏菌 志贺氏菌属 TSI（斜面）K K K K TSI

8、（底层）A A A A TSI（产气）TSI（硫化氢）少量 赖氨酸 MIO（动力）MIO（靛基质）可变 MIO（鸟氨酸）痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌：宋内志贺氏菌：柠檬酸盐（西蒙氏）尿素 3.6 血清学鉴定 挑取 5%羊血琼脂平板上的菌落，进行沙门氏菌和志贺氏菌的血清学鉴定，设盐水对照。3.7 确定鉴定 刮取 5%羊血琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。4 结果与报告 报告粪便标本中检出沙门氏菌或志贺氏菌。5 菌株的保存和上送 培养物穿刺接种半固体培养基，轻拧管盖，36 1 培养 24 h，盖紧管盖。如果需要长期保存菌株，将 0.7 mL 脑心浸液肉汤 6 h12 h 培养物和

9、 0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置70 C 保存。按照方案要求定期上送。（四）致泻大肠埃希氏菌检测操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中致泻大肠埃希氏菌（Diarrheagenic Escherichia coli）的检验方法。2 操作步骤 2.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入 Cary-Blair 运送培养基中的标本应在冷藏条件下 24 h 内

10、送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下 8 h内送检。2.2 直接分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，尽量从可见血或黏液的部位收集；新鲜拭子在 MAC一区划线；以 1 L 无菌接种环或接种针划线分离。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在 MAC 一区划线；以1 L 无菌接种环或接种针划线分离。平板 36 1 培养 18 h24 h。2.3 菌落特征 挑取 5 个可疑大肠埃希氏菌菌落（粉红色、突起、光滑、湿润）直接保存半固体菌种管；采用 PCR 检测特异毒力基因方法鉴别 5 种致泻大肠埃希氏

11、菌。3 多重 PCR 鉴定 3.1 标准菌株 标准菌株一览表见表 3。表3 标准菌株一览表 菌株名称 标准号 来源 EPEC CMCC 44155 中国食品药品检定研究院 STEC 具有stx1、stx2毒力基因 中国疾病预防控制中心传染病所 ETEC CMCC 44815 中国食品药品检定研究院 EIEC CMCC 44825 中国食品药品检定研究院 EAEC 042 血清型 中国疾病预防控制中心传染病所 大肠埃希氏菌 ATCC 25922 WHO 3.2 引物合成 多重 PCR 引物序列见表 4。表4 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列 目标菌 目标基因 引物序列 片段大小（bp）EPE

12、C、STEC escVF 5-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3 544 escVR 5-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3 EPEC bfpBF 5-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3 910 bfpBR 5-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3 STEC stx1AF 5-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3 244 stx1AR 5-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3 stx2AF 5-GTT T

13、TG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3 324 stx2AR 5-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3 ETEC EltF 5-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3 655 EltR 5-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3 estIaF 5-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3 157 estIaR 5-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3 estIbF 5-TGT CTT TTT

14、CAC CTT TCG CTC-3 171 estIbR 5-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3 EIEC invEF 5-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3 766 invER 5-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3 EAEC astAF 5-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3 102 astAR 5-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3 aggRF 5-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3 400 agg

15、RR 5-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3 PicF 5-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3 1111 PicR 5-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3 通用 uidAF 5-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3 1487 uidAR 5-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3 3.3 标本处理 刮取营养平板上的过夜新鲜培养物 1 环2 环，至装有 1 mL0.85%灭菌生理盐水的Eppendorf 管内，混匀。4 8，12 000 r/min 离心 1

16、5 min，弃去上清。沉淀加入 100 L 灭菌去离子水中，混匀。100 煮沸 12 min，12 000 r/min 离心 5 min，上清即为 PCR扩增模板，可直接用于 PCR 反应。3.4 多重 PCR 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增加样体系见表 5。PCR 反应条件：预变性94 5 min。变性 94 30 s，复性 63 30 s，延伸 72 1.5 min，30 个循环。最后 72 延伸 5 min。表5 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增加样体系 试剂 加样体积（L）dH2O 8.3 10PCR Buffer 2.5 25 mM MgCl2 2.5

17、2.5 mM dNTPs 3.0 25 M escVF 0.4 25 M escVR 0.4 25 M bfpBF 0.1 25 M bfpBR 0.1 25 M stx1AF 0.2 25 M stx1AR 0.2 25 M stx2AF 0.4 25 M stx2AR 0.4 25 M eltF 0.1 25 M eltR 0.1 25 M estIaF 0.4 25 M estIaR 0.4 25 M estIbF 0.2 25 M estIbR 0.2 25 M invEF 0.2 25 M invER 0.2 25 M astAF 0.4 25 M astAR 0.4 25 M ag

18、gRF 0.2 25 M aggRR 0.2 25 M picF 0.2 25 M picR 0.2 25 M uidAF 0.2 25 M uidAR 0.2 3 U/L Taq 酶 0.7 DNA 模板 2.0 3.5 检测结果的判定 取 5 L PCR 扩增产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳。根据特异性核酸条带大小和数目判断致泻大肠埃希氏菌的种类。见图 2。图2 种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重 PCR 扩增片段 注：图中标示 EPEC、EHEC（STEC）、ETEC、EIEC、EAEC 的泳道为反应体系中仅存在相应的一种模板和 12 对引物同时扩增后出现的片段，而 MIX 泳道为将五种致泻大肠

19、埃希氏菌混合后与 12 对引物同时扩增后出现的片段。4 血清学鉴定 4.1 挑取 PCR 扩增阳性菌种，营养平板分离，36 1 培养过夜。4.2 根据 PCR 鉴定结果，用相应致病大肠血清 O 多价、单价、K、H 诊断血清进行血清玻片凝集试验进行诊断。见表 6。表6 常见致泻大肠埃希氏菌的 O 血清群及血清型 婴幼儿腹泻 成人和儿童腹泻 EPEC ETEC EIEC STEC EAEC O20 O26 O44 O6:K15:H16 O8:K40:H9 O28ac O157:H7 O9:K99 O55 O86 O111 O8:K25:H9 O8:H47:H-O112 O26:K62:H11 O1

20、01:K99 O114 O119 O125 O11:H27 O15:H11 O124 O111 O126 O127 O128 O20:H-O25:K7:H42 O136 O103 O142 O158 O25:K98:H-O27:H7 O143 O145 O27:H20 O63:H12 O144 O104 O73:H45 O78:H11 O152 O78:H12 O85:H7 O164 O114:H21 O115:H511）O127:H12 O128:H7 O128:H21 O139:H28 O148:H28 O149:H4 O159:H4 O159:H20 O159:H34 O166:H27

21、O169:H-注：1：无动力的变异 4.3 报告血清学实验结果。5 生化鉴定 5.1 对 PCR 阳性、血清学可分型及不可分型菌株进行系统生化鉴定。5.2 报告最终鉴定结果。6 菌株保存和上送 4 或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少 2 套（穿刺接种后 36 培养过夜即可）或 30%甘油肉汤冻存管-70 保存菌株至少 2 套。按照要求定期上送。（五）大肠埃希氏菌 O157:H7 检测操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中大肠埃希氏菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）的检验方法。2 检验程序 大肠埃希氏菌O157:H7检验程序见图3。图3 大肠埃希氏菌 O1

22、57:H7 检验程序 3 操作步骤 3.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入 Cary-Blair 运送培养基中的标本应在冷藏条件下 24 h 内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下 8 h内送检。3.2 增菌培养 增菌液采用添加 20 mg/L 新生霉素的改良 EC 肉汤（EC）。将采集的一支便拭子 1:1036 1，16 h2

23、0 h 粪便或肛拭子 mEC 肉汤 报告 胶体金试纸筛检阳性 革兰氏染色 血清学鉴定 靛基质（+）甲基红（+）V-P（-）柠檬酸盐（-）溶血素基因 志贺毒素基因 eae基因等 36 1，9 h12 h 免疫磁珠捕获 CT-SMAC 和改良科玛嘉 O157：H7 显色平板 挑取 1020 个可疑菌落，接种 KIA、MIU 36 1，16 h20 h 生化鉴定 毒力因子鉴定 O157 多价（+）O157 单价（+）H7 多价（+）接种于 6 mL mEC 肉汤，36 1 恒温摇床增菌培养 6 h（如无摇床，36 1 恒温增菌培养 9 h12 h）。3.3 大肠埃希氏菌 O157:H7 胶体金试纸快

24、速筛查 3.3.1 将胶体金试纸从袋中取出，平放于洁净、干燥的工作台上，编号；3.3.2 用加样器吸取样品增菌液 150 L，加入检测卡一端的加样孔；3.3.3 2 min20 min 内读取结果。阴性样品在视窗上部出现一条单一的红色对照线，这表明试剂已正确流动且检测过程已发生。阳性样品将显示两条红色带，这表明检出 O157 抗原。如果红色条带出现，实验失败，应考虑重做。3.4 免疫磁珠集菌 将 O157 胶体金试纸呈阳性的 mEC 增菌肉汤，进行免疫磁珠集菌。3.4.1 取下磁铁板，将编好号的 1.5 mL 的 Eppendorf 离心管，置入 Dynal MPC-M 架上。3.4.2 轻柔

25、混匀抗 O157 免疫磁珠（反复颠倒，直到管底沉淀完全消失），吸取抗 O157免疫磁珠，置入每只编号的 Eppendorf 离心管中 20 L。3.4.3 取胶体金试纸阳性增菌培养物 1 mL，加入上述对应的 Eppendorf 离心管中。盖紧盖子。轻轻颠倒混匀。3.4.4 置于 Dynal MX3 旋转培养器上，室温下，旋转 30 min（如果没有旋转器，可人工旋转）。3.4.5 将磁铁板插入 Dynal MPC-M 管架中，反复颠倒数次，将抗 O157 免疫磁珠吸附沉淀在 Eppendorf 离心管壁上。吸去上清（包括残留在管盖上的液体），并弃掉。3.4.6 将磁铁板从Dynal MPC-

26、M架抽出。每只Eppendorf离心管中加入1 mL PBS-Tween20（PH7.4），轻轻颠倒混匀，重新悬浮免疫磁珠。3.4.7 重复 3.4.53.4.6 步骤 3.4.8 重复 3.4.5 步骤。3.4.9 用 50 L PBS-Tween20 重新悬浮免疫磁珠细菌混合物。3.5 接种选择性平板 将 50 L 免疫磁珠细菌混合物用接种环划线或 L 棒涂布分别接种于 O157:H7 科玛嘉显色平板或山梨醇麦康凯平板（SMAC）各一块，36 1 培养 18 h24 h；在 SMAC 平板上 O157:H7 菌落应为扁平、透明或半透明、表面光滑湿润、不发酵山梨醇乳白色菌落，极少部分迟缓发酵

27、山梨醇，呈红色。边缘光滑，直径约 2 mm。在 O157：H7科玛嘉显色培养基上呈淡紫色或紫红色菌落。3.6 初步鉴定 对疑似菌落染色为革兰阴性杆菌者，在上述平板挑取疑似菌落 1020 个，转种克氏双糖（KIA）培养基，36 1 培养 16 h20 h。如其生长性状为葡萄糖（+）、乳糖（+）、产气（+）、硫化氢（-）者。3.7 诊断血清凝集试验 可疑菌株可用大肠埃希氏菌 O157 抗血清和 O157 单克隆抗体进行玻片凝集，凝集强度达（+），再用 H7 抗血清凝集鉴定。同时设盐水做对照。上述，冷冻，真空抽干，并于真空状态下封口保存。若患者不能自然排除 O157:H7 与肠杆菌科的某些菌种存在抗

28、原交叉现象，例如：弗劳地柠檬酸杆菌、赫尔曼埃希氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌等，一般可通过单克隆抗体解决，但弗劳地枸椽酸杆菌与 O157:H7 的 O 抗原交叉反应用单克隆抗体也无法辨别，只可通过检测 O 抗原编码基因鉴别。3.8 API 20E 生化鉴定试剂盒 采用 API 20E 生化鉴定试剂盒进行鉴定，生化反应编码:大多为 5144172，极少数为1144172 或 5144162。4 菌株保存和定期上送 4 或室温保存的半固体培养基保菌菌种至少 2 套（穿刺接种后 36 培养过夜即可）或 30%甘油肉汤冻存管-70 保存菌株至少 2 套。按照方案要求定期上送。5 多重 PCR 毒

29、力基因鉴定 PCR 扩增 O157、H7 编码基因，并且检测stx1、stx2、hly、eae毒力基因。典型的造成人类感染的大肠埃希氏菌 O157:H7 为 O157+、H7+，并且携带志贺毒素、溶血素与粘附抹平因子：stx1+、stx2+、hly+、eae+，我国大部分 O157:H7 菌株不携带stx1，为stx1-、stx2+、hly+、eae+。多重 PCR 各对引物序列见表 7。表7 多重 PCR 毒力基因鉴定的引物 目标基因 引物序列 片段大小（bp）stx1 F 5-ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC-3 R 5-AGA ACG CCC ACT GAG

30、ATC ATC-3 180 stx2 F 5-GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-3 R 5-TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT-3 255 eaeA F 5-GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC-3 R 5-CCA CCT GCA GCA ACA AGA GG-3 384 hlyA F 5-GCA TCA TCA AGC GTA CGT TCC-3 R 5-AAT GAG CCA AGC TGG TTA AGC T-3 534 rfbO157 F 5-CGG ACA TCC ATG TGA TAT GG-3 R 5-TTG CCT AT

31、G TAC AGC TAA TCC-3 259 5.1 模板 DNA 提取：用热裂解法，将纯化的可疑菌株接种 5 mL 营养肉汤，36 1 培养 6 h 或过夜，10 000 r/min 离心 5 min，弃上清；加入 1 mL 生理盐水，震荡分散细菌，10 000 r/min离心5 min，弃上清；沉淀加 100 L无菌蒸馏水，重新震荡悬浮后置100 水浴10 min；10 000 r/min 离心 5 min，上清用于 PCR 扩增。阳性和阴性对照分别为我们保存的产志贺氏毒素 1 和 2 的大肠埃希氏菌 O157:H7 和不具备上述 6 种基因的大肠埃希氏菌，同法制备。5.2 多重 PCR

32、 反应体系：模板 DNA 提取液 5 L，10PCR 缓冲液 5 L，分别加终浓度1.5 mMMgCl2，0.2 mM dNTP，每种引物 500 nM，Taq DNA 聚合酶 1.5 L，最后加无菌蒸馏水至总体积 50 L。5.3 多重 PCR 反应条件：除变性温度由 95 改为 94 和增加最后 72 延伸外，均按Paton 法。110 循环，94 1 min 变性；65 2 min 退火；72 1.5 min 延伸。1125循环，94 1 min；60 2 min；72 1.5 min。2635 循环，94 1 min；65 2 min；72 2.5 min。最后 72 10 min。5

33、.4 扩增产物用含 EB（0.5 g/mL）的 2%琼脂糖电泳，阳阴性对照正常，紫外灯下观察结果，照相记录。（六）副溶血性弧菌检验操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。2 检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图4。图4 副溶血性弧菌检验程序 3 操作步骤 3.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。所采集的标本尽快检验，放入

34、 Cary-Blair 运送培养基中的标本应在室温条件下 24 h 内送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，室温条件下 8 h内送检。3.2 分离培养 36 1，12 h16 h 36 1，18 h24 h 粪便或肛拭子 挑取 3 个或以上可疑菌落，接种于 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 进行系统生化鉴定 结果与报告 血清学分型、PCR 毒力基因鉴定 氧化酶试验，3氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验 3氯化钠碱性蛋白胨水 TCBS 或科玛嘉弧菌显色培养基 36 1，18 h24 h 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便，将拭子放入 3%氯化钠碱性蛋白胨水。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层

35、标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；将拭子放入 3%氯化钠碱性蛋白胨水。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入碱性蛋白胨水。碱性蛋白胨水于 36 1 培养 12 h16 h，于 TCBS 平板或科玛嘉弧菌显色培养基平板上划线分离，36 1 培养 18 h24 h。3.3 菌落特征 典型的副溶血性弧菌在 TCBS 上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径 2 mm3 mm。从培养箱取出 TCBS 平板后，应尽快（不超过 1 h）挑取菌落或

36、标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科玛嘉弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径 2 mm3 mm。3.4 纯培养 挑取 3 个或以上可疑菌落，划线接种 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 1 培养 18 h24 h。3.5 初步鉴定 3.5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。3.5.2 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 1 培养 24 h 观察结果。副溶血性弧菌在 3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力。3.5.3 嗜盐性试验：挑取纯培养的

37、单个可疑菌落，分别接种 0%、6%、8%和 10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 1 培养 24 h，观察液体混浊情况。副溶血性弧菌在无氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在 6%氯化钠和 8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。3.6 确定鉴定 刮取 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定试剂盒鉴定。4 血清学分型 4.1 制备：接种两管 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，36 1 培养 18 h24 h。用含 3%氯化钠的 5%甘油溶液冲洗 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂斜面培养物，获得浓厚的菌悬液。4.2 K 抗原的鉴定：取一管上述制备好的菌悬液，首先用多价 K 抗血

38、清进行检测，出现凝集反应时再用单个的抗血清进行检测。用蜡笔在一张玻片上划出适当数量的间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液，并对应加入一滴 K 抗血清。在对照间隔内加一滴 3%氯化钠溶液。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片 1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。4.3 O 抗原的鉴定：将另外一管的菌悬液转移到离心管内，121 高压 1 h。高压后 4 000 r/min 离心 15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗三次，每次 4 000 r/min 离心 15 min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液。用蜡笔将玻片划分成相等的间隔。在每个间隔内加入一滴

39、菌悬液，将 O 群血清分别加一滴到间隔内，最后一个间隔加一滴生理盐水作为自凝对照。轻微倾斜玻片，使各成分相混合，再前后倾动玻片 1 min。阳性凝集反应应可以立即观察到。如果未见到与 O 群血清的凝集反应，将菌悬液 121 再次高压 1 h后，重新检测。如果仍旧为阴性，则培养物的 O 抗原属于未知。根据表 8 报告血清学分型结果。表8 副溶血性弧菌的抗原 O 群 K 型 1 1，5，20，25，26，32，38，41，56，58，60，64，69 2 3，28 3 4，5，6，7，25，29，30，31，33，37，43，45，48，54，56，57，58，59，72，75 4 4，8，9，1

40、0，11，12，13，34，42，49，53，55，63，67，68，73 5 15，17，30，47，60，61，68 6 18，46 7 19 8 20，21，22，39，41，70，74 9 23，44 10 24，71 11 19，36，40，46，50，51，61 12 19，52，61，66 13 65 5 PCR 毒力基因鉴定 PCR 法检测tdh（耐热直接溶血素基因）和trh（TDH 相关溶血素基因）毒力基因，引物序列见表 9。5.1 模板 DNA 提取：自 TCBS 或科玛嘉弧菌显色平板上挑取 3 个可疑菌落，划线含 3%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂平板。纯化菌株在含 3%氯化钠

41、的脑心浸液肉汤中 36 1 过夜生长，10 000g 离心 10 min。沉淀用无菌生理盐水洗涤 2 次，重新悬浮于双蒸水中，煮沸10 min。细菌裂解物立即用于 PCR 或-20 保存备用。5.2 PCR 反应体系中包括含 DNA 的细菌裂解物 2 L，20 mol/L 的引物贮存液各 1 L，dNTP 贮存液（各种 dNTP 的浓度为 2.5 mmol/l）1 L，Taq 聚合酶 0.3 L（TaKaRa），10PCR缓冲液 5 L，总体积 50 L。5.3 反应体系 94 预变性 5 min。PCR 的循环条件见表 9。反应体系 72 再延伸 5 min。所有反应均设立阳性对照和阴性 D

42、NA 对照。PCR 产物在 2%的琼脂凝胶中 120 V 电泳，EB 染色，照相。5.4 PCR 产物在 2%的琼脂凝胶中 120 V 电泳，EB 染色，照相。表9 鉴定致病性副溶血性弧菌的引物 目标基因 引物序列 片段大小（bp）PCR 条件 循环 次数 tdh基因 TDH-1:5-AGC TTC CAT CTG TCC CTT TT-3 TDH-2:5-ATT ACC ACT ACC ACT CTC ATA-3 434 94 1 min 55 1 min 72 1 min 30 trh基因 R2:5-GGC TCA AAA TGG TTA AGC G-3 R6:5-CAT TTC CGC

43、TCT CAT ATG C-3 250 94 1 min 55 1 min 72 1 min 30 6 结果与报告 当检出的可疑菌落生化性状符合表 10 要求时，报告粪便标本中检出副溶血性弧菌。副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表 11。7 菌株的保存和上送 培养物穿刺接种 3%氯化钠半固体培养基，轻拧管盖，36 1 培养 24 h，盖紧管盖。也可以在动力试验培养基 24 h 培养物上加入一层灭菌矿物油。室温贮存培养物，不要冷藏。如果需要长期保存菌株，将 0.7 mL 3%氯化钠脑心浸液肉汤 6 h12 h 培养物和 0.3 mL 灭菌甘油加入灭菌菌种管，立即放置70 C 保存。按照方案要

44、求定期上送。表10 副溶血性弧菌的生化性状 试验项目 结果 革兰氏染色镜检 阴性，无芽胞 氧化酶 动力 蔗糖 葡萄糖 甘露醇 分解葡萄糖产气 乳糖 硫化氢 赖氨酸脱羧酶 V-P ONPG 注：阳性；阴性。表11 副溶血性弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别 名称 氧化酶 赖氨酸 精氨酸 鸟氨酸 明胶 脲酶 V P 42生长 蔗糖 D纤维二糖 乳糖 阿拉伯糖 D甘露糖 D甘露醇 ONPG 嗜盐性试验 氯化钠含量/%0 3 6 8 10 副溶血性弧菌 V.parahaemolyticus V V 创伤弧菌 V.vulnificus V 溶藻弧菌 V.alginolyticus 霍乱弧菌 V V.chole

45、rae 拟态弧菌 V.mimicus 河弧菌 V.fluvialis V V 弗氏弧菌 V.furnissii 梅氏弧菌 V.metschnikovii V V 霍利斯弧菌 V.hollisae nd 注：nd 表示未试验；V 表示可变。（七）小肠结肠炎耶尔森氏菌检测操作程序 1 范围 本程序规定了粪便标本中小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）的检验方法。2 检验程序 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图5。图5 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序 3 操作步骤 3.1 标本收集 标本包括新鲜的或转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便或肛拭子。最优标本是转移至C

46、ary-Blair 运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。肛拭子收集后应当目测，需要在拭子上明显见到粪便。4 冷增菌，10 d20 d 与改良PBS增菌液1:10混合 粪便或肛拭子 直接 CIN 耶尔森氏菌选择性平板 挑取 3 个或以上可疑菌落，接种改良克氏双糖铁琼脂 25，24 h48 h 25，24 h 尿素酶试验 25，24 h 尿素阳性者分别接种 2 管半固体培养基 25，24 h 36 1，24 h 动力（）动力（）动力（）动力（）且 进行系统生化鉴定 报告 所采集的标本尽快检验，放入 Cary-Blair 运送培养基中的标本应在冷藏条件下 24 h 内

47、送检。新鲜的粪便标本置于清洁、干燥、无肥皂或消毒液残留的容器中，冷藏条件下 8 h内送检。3.2 分离培养 3.2.1 直接分离培养 新鲜粪便：无菌拭子采集少量粪便；新鲜拭子在 CIN 耶尔森氏菌选择性平板一区划线；以 1 L 无菌接种环或接种针划线分离。在标本中再插入一个清洁的无菌拭子，将拭子放入改良 PBS 增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入改良磷酸盐增菌液。肛拭子：操作程序同新鲜粪便。转移至 Cary-Blair 运送培养基的粪便拭子：轻搅混合标本；拭子在 CIN 耶尔森氏菌选择性平板一区划线；以 1 L 无菌接种环或接种针划线分离；在标本中再插入一个清

48、洁的无菌拭子，将拭子放入改良磷酸盐增菌液。轻拧管盖。注意：拭子表面有一层标本即可，不可将过量的标本放入改良 PBS 增菌液。平板 25 培养 24 h48 h。3.2.2 增菌培养 取约 1 g 粪便标本接种于 10 mL 改良磷酸盐缓冲液，于 4 分别增菌培养 7 d、14 d和 21 d 后取增菌培养物转种 CIN 耶尔森氏菌选择性平板，25 培养 24 h48 h。3.3 菌落特征 典型的小肠结肠炎耶尔森氏菌在 CIN 耶尔森氏菌选择性培养基上呈较小的湿润菌落，直径约 1 mm2 mm。中心呈深玫瑰红色，凸起较尖锐，周围有明显透明环，称“公牛眼”。3.4 纯培养 挑取 3 个或以上可疑菌

49、落，划线接种营养琼脂平板，25 培养 24 h。3.5 初步鉴定 3.5.1 糖分解试验：挑取可疑菌落接种改良克氏双糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25 培养 24 h48 h。挑选斜面/底层均变黄（A/A），不产 H2S，不产气（可能有微量气体，小泡，但不会将培养基顶裂或顶起）的菌株进一步鉴定。3.5.2 尿素分解试验：刮取斜面上大量菌苔，浓厚接种于尿素培养基，震荡均匀，25 培养 2 h4 h，变红色者为尿素酶阳性，进一步检测动力。菌量少及其他未变色的菌株观察至 24 h。3.5.3 动力试验：将尿素酶阳性菌株接种于 2 管半固体，分别置于 25 与 36 1 培养 24 h。选取 26 动力

50、（+）且 36 1 动力（）的菌株，进行系统生化鉴定。3.6 确定鉴定 刮取胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个菌落，进行系统生化鉴定。4 血清学分型 使用致病性菌株常见血清型（我国一般为 O:3、O:8、O:9 型）的特异性单克隆抗体进行玻片凝集，进行血清分型。5 PCR 毒力基因鉴定 PCR 法检测小肠结肠炎耶尔森氏菌 ail（粘附侵袭位点基因）、ystA（耐热性肠毒素 A）、ystB（黏附素基因）、virF（毒力因子基因）毒力基因，引物序列见表 12。O:3 血清型菌株rfbC 扩增结果为阳性（rfbC+）。典型的致病性菌株的毒力基因的分布为 ail+、ystA+、yadA+、virF+、yst