天然药物有效成分提取分离技术研38123.pdf

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1、-天然药物有效成分提取别离技术 中草药以植物药为主，而植物都是由复杂的化学成分所组成。其中主要有纤维素、叶绿素、单糖、低聚糖和淀粉、蛋白质和酶、油脂和蜡、树脂、树胶、鞣质及无机盐等。其中，许多物质对植物机体生命活动来说不可缺少，称为一次代谢产物。一般认为它们在药用上是无效成分或杂质。而另外一些化学成分如：生物碱、黄酮、蒽醌、香豆素、木脂素、有机酸、氨基酸、萜类、苷类等对维持植物生命活动来说不起重要作用，称为二次代谢产物，这些物质在植物体内虽含量很少，多则百之几，少则百万分之几，甚至更少。但它们往往具有较强的生理活性，其中有些已应用于临床，我们称之为有效成分。当然有效成分与无效成分的划分是相对的

2、，如天花粉的引产有效成分是蛋白质，香茹中的多糖对实验动物肿瘤有显著的抑制作用。在进展中草药成分提取前，应注意对所用材料的原植物品种的鉴定并留样备查。同时要系统查阅文献，以充分了解，利用前人的经历。中草药有效成分的提取别离一般有下面两种情况：第一、从植物中提取的有效成分或的化学构造类型者。如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素；三棵针中提取黄连素等(提取有效成分)。或从植物中提取*类成分如总生物碱、总酸性成分。如从银杏叶中提取总黄酮；从大黄中提取总蒽醌(提取有效部位)。工作程序比拟简单。一般先查阅有关资料，特别是工业生产的方法，搜集比拟该种或该类成分的各种提取方法，再根据具体条件加以选用。(注意

3、先重复该方法，得到产品后，再结合生产实际，不断改良工艺，到达大生产要求)。-第二、从中草药中寻找未知有效成分或有效部位时，情况比拟复杂。只能根据预先确定的目标，在临床或药理试验配合下，经不同溶剂提取，以确定有效部位。然后再逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效成分。一、中草药有效成分的提取 对中草药化学成分的提取，通常是利用适当的溶剂或适当的方法将植物中的化学成分从植物中抽提出来。常用的方法有溶剂法、水蒸汽蒸馏法和升华法等。其中后两种方法的应用*围十分有限。现分别介绍如下：一溶剂提取法 1、溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，

4、对不需要溶出的成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。根据“相似者相溶的经历规律，中药化学成分可通过构造去估计它们的性质，亲脂性的中药成分易溶于亲脂性溶剂，难溶于亲水性溶剂。反之，亲水性成分则易溶于亲水性溶剂。据此，可选择适当溶剂从中药中提取所需成分。常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序表示如下：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇 1、水提取法 水是一种强杉性溶剂。中草药中亲水性成分如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐和苷类等都能被水溶出。-游离生物碱可与酸生成盐而溶于水，因而可用酸水提取。有机酸、黄酮、蒽醌、内酯香豆素和酚类成分可与碱成盐

5、而溶于水，可用碱水提取。提取方法可分为水煎、水浸和水渗鹿三种。例：从三棵针中提取小檗碱；从槐米中提取芦丁；从甘草中提取甘草酸等。2、醇类溶剂提取法 大多数中草药成分都可用醇EtOH,MeOH或含水、含酸的醇来提取。以乙醇最为常用，由于醇类溶剂兼有亲水性的醇羟基和亲脂性的烷基，因此，具有溶解度*围大，适用*围广的特点。除了强亲水性蛋白质、多糖、无机盐；强亲脂性叶绿素、油酯、脂溶性色素、蜡等成分外，其他成分都可用醇来提取。在实验室和工业生产中，该方法使用最为普遍。提取方法：冷提、回流提取 3、亲脂性有机溶剂提取 一般适用于挥发油、油酯、叶绿素、植物甾醇、萜类、游离生物碱及苷元等弱极性成分的提取。例

6、：从穿地龙中提取薯蓣皂苷元用溶剂汽油；萝芙木根中提取利血平苯为溶剂。提取方法：回流提取；连续提取。4、二氧化碳超临界萃取。5、利用膨缩原理提取-6、超声提取 二水蒸汽蒸馏法 该法只适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏，与水一发生反响，而且难学或不溶于水的成分的提取。中草药中的挥发油及*些挥发性成分能用水蒸汽蒸馏法得到。但应用*围有限。例：麻黄碱、菸碱、槟榔碱、牡丹酚、大蒜素的提取。三升华法 固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可利用升华法直接自中草药中提取出来。如：樟木可樟脑；茶叶中咖啡碱；大黄中游离羟基蒽醌的提取。二、中草药有效成分

7、的别离和精制 1、结晶和重结晶 结晶法是别离和精制固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同到达别离的方法。一般来说，从不是结晶状物质处理得到结晶状物质，这一步叫结晶。从比拟不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶，称重结晶。采用结晶法首先要注意结晶的条件如选择适宜的溶剂、适宜的温度和时间、有效成分在欲结晶的混合物中的含量等。其中最主要的是选择适宜的溶剂。该溶剂对欲纯化的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热都易溶。其次是有效成分在待结晶的混合物中的含量，一般说含量愈高愈容易结晶，有的化合物要比拟单纯时才能得到结晶。因此，-必须注意中药的粗提物先用其它方法

8、尽量除去杂质后，再采用此法。2、沉淀法 溶剂沉淀法：在溶液中参加另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一局部物质沉淀析出，从而实现别离的方法。常见的有 a.在药材浓缩水提取液中参加数倍量高浓度乙醇水提醇沉法，以沉淀除去糖类、蛋白质、果胶、无机盐等水溶性杂质；从中草药中提取多糖类成分也可采用此法。b.醇提水沉法：在浓缩乙醇提取液中参加数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、果胶、粘液质、叶绿素等水不溶性杂质。C.醇/醚法或醇/丙酮法：该法主要用于沉淀皂苷类成分，而将脂溶性的树脂等类杂质留在母液中，一般将粗皂苷溶于少量醇中，然后逐滴参加乙醚或丙酮，摇均，皂苷即析出。酸碱沉淀法：对酸性、碱性或两性有机化合物来

9、说，可通过参加酸、碱以调节溶液的 pH 值，改变分子的存在状态游离型或解离型，从而改变溶解度而实现别离。a.酸提取碱沉淀法：主要用于生物碱的别离精制，含生物碱的药材用酸性水提出后，加碱调至碱性生物碱即可沉淀析出。b.碱提取酸沉淀法：主要适用于黄酮、蒽醌及其它酚酸性成分的别离和精制。金属盐沉淀法：常用铅盐中性和碱性醋酸铅、钡盐、钙盐、铜盐等。例中性皂苷和酸性皂苷的别离可用铅盐法，向混合皂苷的水溶液或醇溶液中先参加中性醋酸铅则酸性皂苷形成铅盐沉淀，而中性皂苷则留于溶液中，据此，可将两者分开。另外，在粗制皂苷的水溶液中参加碳酸铜溶液，搅拌，可使鞣质、色素等杂质沉出除去。-试剂沉淀法：别离生物碱尤其是

10、水溶性生物碱常参加苦味酸、苦酮酸、雷氏铵盐等生物碱沉淀试剂，生成的生物碱盐通过复分解反响或参加无机盐处理又得到原来的生物碱。胆甾醇试剂常用于沉淀甾体皂苷，从而与三萜皂苷分开。3、pH 梯度萃取法：将被别离物质溶解在与水不相溶的有机溶剂中，用碱水使 pH 由低到高或用酸性水使 pH 由高到低，依次萃取，到达别离目的的方法。常用于不同碱度的生物碱别离和不同酸度的蒽醌苷元和黄酮苷元的别离。4、盐析法：在中药的水提液中，参加无机盐至一定浓度，或到达饱和状态，可使*些成分在水中的溶解度降低而析出沉淀，从而与水溶性大的杂质别离。常用作盐析的无机盐的氯化钠、硫 钠、硫酸镁、硫酸铵等。例三七的水提液中参加硫酸

11、镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出；自黄藤中提取掌叶防己碱；自三棵针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠盐析制备；将羊角拗和酒精提取物溶于水，水液用铅盐法除去杂质后，参加硫酸铵饱和，即析出粗强心苷。5、透析法：利用小分子及小离子在溶液中可通过半透膜，而分子及大离子不能通过的性质，借以到达别离。例如别离纯化皂苷，蛋白质、多肽、多糖等成分时，可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。6、两相溶剂萃取法 液-液萃取与分配系数 K 值 两相溶剂萃取法定义：利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶-剂中分配民系数的不同而到达别离的方法叫两相溶剂萃取法。溶质在两相溶剂中的分配系数 K 在一定温度及压力下为

12、一常数：K=CU/CL K：分配系数 CU：示溶质在上相溶剂中的浓度 CL：示溶质在下相溶剂中的浓度。假定：A、B 两种溶质用氯仿/水进展分配，A、B 均为 1 克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比 VCHCl3/VH2O=1 则在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，溶质 A90%以上分配到上相溶剂中，10%以下分配到下相溶剂中。计算方法：KA=10/1 A=10/11100%=90.91%。同理：溶质 B 的分配与 A 相反，10%以下在上相中，90%以上在下相中。计算方法：KB=0.1=1/10 B=1/11100%=9.09%。别离难易与别离因子 别离因子 可定义为 A、B 两种溶质

13、在同一溶剂系统中分配系数的比值。=KA/KB(注：KA KB)，上例中，=KA/KB=10/0.1=100 100 仅作一次简单萃取就可实现根本别离 10010 则须萃取 10-12 次 2 须作 100 次以上萃取 1 则 KA KB意味着两者性质极其相近，或甚至即为同一物质，故即使作任意次分配也无法实现别离。分配比(系数)与 PH 对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统 PH-的影响。原因是 PH 变化可以改变它们的存在状态(游离型或解离型)，从而影响在溶剂系统中的分配比。对酸性物质(HA)，其在水中的解离平衡及解离常数 K 可用下式表示：两边取负对数 注：Ka 越大，酸性越

14、强；PKa 值越小，酸性越强。假设使该酸性物质完全解离，即使 HA 均转变成 A-，则 故 假设使该酸性物质完全游离，即使 A-均变成 HA 则 酚类化合物 PKa 值一般为；羧酸类化合物 PKa 值约为 5。因而 PH3 以下，大局部酸性物质将以非解离形式(HA)存在，易分配于有机溶剂中，而 PH12 以上时，则将以解离形式(A-)存在，易分配于水中。同理，对碱性物质(B)，其碱性强弱可用其共轭酸(BH+)的解离常数 Ka-或 PKa-值表示。Ka-越小，碱性越强；PKa-越大，碱性越强。一般 PH12，则酸性物质呈解离状态(A-)，碱性物质则呈非解离状态(B)存在。据此，可利用 PH 值的

15、不同将酸、碱物质分开。三、层析法 Chromatography PKa=PH-log A-HAPH=PKa+logA-HAPKa+log1001()PHPKa+2PHPKa-2BH+H2OB+H2+O（共轭酸）（共轭碱）Ka-=B H3+O BH+PKa-=PH-log B BH+-层析技术目前已广泛应用于各种化合物的别离分析，开展很快，它已成为化学实验室不可缺少的分析别离手段。层析法是一种使不同分子相互别离的过程，当一混样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体移动相通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使用权各组分通过固定相支持体的速成率不同而得到期别离。按其操作方法，在

16、柱上进展称为柱层析；在薄层上进展称为薄层层析；在纸上进展称为纸层析。层析法按别离原理可分为吸附层析 利用吸附剂对样品吸附能力的差异进展别离；分配层析利用样品组分在二种不相互溶的溶剂中分配系数的不同进展别离；离子交换层析利用样品组分在离子交换树脂上交换能力大小不同进展别离；凝胶层析利用分子筛别离物质的一种方法。(一)薄层层析：薄层层析是 50 年代初开展起来的一种新型、快速、简单、高效的层析法。薄层层析的操作方法是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用适宜的溶剂展开而到达别离、鉴定和定量的目的，因为岐析是在薄层上进展，所以称它为薄层层析。薄层层析在天然药物化学中应用：天然

17、药物化学成分的予试验；中药中有效成分的鉴定须用标准品或对照品进展对照；别离得到的有效成分或单体的纯度判断；小量样品的制备；探索柱层析别离的条件。薄层层析优点：-价廉、设备简单、易于操作；展开时间短，一般只须数分钟到期数十分钟；斑点扩散小，检出灵敏度高；别离情况受温度影响小；可以使用腐蚀性试剂。薄层层析缺点：Rf 值重现性差因此，为了克制这一缺点，通常将标准品与样品在同一薄层板上同时层析；用大的薄层板展开时，容易出现边缘效应；色谱图不易保存。吸附剂的选择 国内常用的吸附剂有硅胶、聚酰胺和纤维素。氧化铝已经不常用。其中硅胶由于它们的吸附性能良好，适用于各类化合物的别离，应用最广。硅胶商品常见的有以

18、下几种硅胶 G：粘合剂为石膏 Gypsum；硅胶 H：不含石膏和其它有机粘合剂；硅胶 HF254：不含粘合剂，但含有一种无机荧光剂。薄层的制备 薄层板常分为软板和硬板两种，软板常用 520cm的玻璃板；硬板常用 7.52.5cm 的显微镜载玻片。软板的制备是选用一根直径为 1-1.2cm 的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布。把吸附剂倒在玻璃板上，用玻璃管将吸附剂顺一个方向推动，即成薄层。硬板的制备是用 stahl 涂布器或手工方法铺板。国内一般都采用手工方法铺板。铺板考前须知：用蒸馏水调制吸附剂时，有时为了把气泡赶尽，可加 1-2 滴乙醇消-泡；国内产硅胶 G 中的石膏经常不起粘合

19、作用，因此，常用 2的CMC-Na溶液调硅胶G制成硬板。薄层层析操作方法参见其它专著。薄层层析操作考前须知：样品点在距离薄层下端 1-1.5cm 处，样品原点的直径要小(2-3mm)，如一次点样量不够，可在溶剂挥发后重复点样；样品量要适中。样品量太少时，样品中含量少的成分不易检出，但样品量太多会形成斑点过大互相穿插或拖尾而不能到达很好的别离；被检样品用适宜的溶剂溶解(尽量防止用水、甲醇)，但有时样品只能用水、甲醇作溶剂时，点样时，要注意斑点的扩散(每次点样量要小，点样后可采用电吹风吹干或在水浴锅上加热挥干后，再重复点样)，点样完毕后，也要将水和甲醇挥去以后，才能进展展开，否则得不到较好的别离效

20、果(原因：水和甲醇会改变展开剂极性；展开剂多为有机溶剂，由于水和展开剂互不相溶，展开剂展开时开场会绕着原点展开)。点样时防止将固体物质点到薄层上，否则，当展开剂 时样品边溶解，边移动，形成严重拖尾，组分穿插重叠，达不到别离目的。有些展开剂中因含有水，有时可能会分层，此时一定要将水分去后，方能展开，否则层析失败，观察不到很好的斑点。展开剂 层析过程中溶剂的选择对组分别离关系极大。在国内，可供选择的吸附剂种类不多，而展开剂的种类很多，不仅可用单一溶剂，而且常用各种配比的混合溶剂。因此，在进展薄层层析时，选择展开剂比选择吸附剂要复杂的多。-选择展开剂时，在吸附薄层上，主要是考虑展开剂的极性；被别离物

21、质在展开剂中的溶解度；在分配薄层上，根据被别离物质在两相溶剂中的溶解度来选择。这里着重讨论吸附层析的情况。一般说来，当吸附剂选定之后，在同一吸附剂上展开剂的极性越大，则对同一化合物的冼脱能力也越大，即在薄层上能把它推得越远，Rf 值越大。因此，如果用*种展开剂去展开*一化合物时，当 Rf值太小时，就要考虑换用一种极性较大的溶剂去展开；Rf 值过大时，就降低溶剂的极性。在进展薄层层析时，除了考虑吸附剂和展开剂，还要考虑被别离物质的极性大小。被别离物质、吸附剂和展开剂三者既相互联系又相互制约，三者之间的关系可用以下图表示：在实际工作中，应注意前人有经历，再结合自己的条件加以选择。特殊薄层及薄层新进

22、展：荧光薄层：在吸附剂中参加荧光性物质，制成的薄层，用于不显色或不能显色的物质别离。络合薄层：硝酸银薄层，用于别离碳原子数目相等而其中碳碳双键数目不等的一系列化合物。其主要机理是由于碳碳双键能与硝酸银形成络合物，而饱和的碳碳单键则不与硝酸银络合。硼酸薄层用于别离糖类化合物。其原理是利用硼酸与糖分子中羟基的络合作用于以到达别离。酸碱薄层：在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制的薄-层。薄层新进展：烧结薄层层析；高效薄层层析；有浓缩区的薄层层析；双波长薄层层析扫描。(二)硅胶柱层析 硅胶的应用*围比拟广，既能用于非极性物质的别离，也能用于极性化合物的别离。如挥发油、萜类、甾体化合物、生物碱、苷类、

23、蒽醌、酚酸类化合物等。硅胶的活性与含水量有关，含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达 17%以上时，吸附能力极低，而可作为分配层析载体。含水量 0 5 15 25 38 活度级 1 2 3 4 5 1、装柱 干法装柱 将层析柱垂直固定在铁支架上，柱底填上一块棉花如柱底有烧结层可不垫棉花，可以垫一*滤纸，翻开活塞。将硅胶经漏斗慢慢装入柱中，边填装，边用橡皮塞轻轻敲击层析柱，使其填装均匀严密，最后使吸附剂外表形成一水平面。该法优点 装柱速度快，洗脱剂用量少；缺点 由于硅胶外表和吸附剂间隙带有空气，影响别离效果。湿法装柱 将硅胶混悬于洗脱剂中，不断搅拌待空气除去后，连同溶剂一起倾入，否则由于不同粒度

24、大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段，容易影响别离效果。翻开活塞，放出上面过多的洗脱剂。使洗脱剂盖过硅胶外表数厘米为宜。用橡皮塞轻轻敲击层析柱。要求在层析柱四周敲击均匀，否则，由于层析柱两侧硅胶严密-程度不一，造成色谱带产生斜面，影响别离效果。敲击顺序就为从下逐步往上。2、上样 湿法上样 一般将样品溶于洗脱剂中轻轻注入已准备好的硅胶柱上面，勿使硅胶柱面受到扰动，否则将影响层析效果，所用样品洗脱 剂要少，使样品在硅胶柱上形成狭窄的原始谱带。干法上样 如果样品在所选装柱洗脱剂中不易溶解，则可将样品溶于能溶的溶剂中，再用不到装柱用量的 1/20 的吸附剂拌匀，然后将溶剂挥发干净(有时需研粉)

25、，再按一般装柱法将带有样品的硅 胶加在层析柱中硅胶上面。上样时注意除去样品硅胶中的气泡。3、考前须知 层析柱内径与柱长之比一般为 1:10-20。样品量与吸附剂比例 硅胶一般为 1:100-300；较难别离者有时甚至可达 1:500-1000；聚酰胺为 1:20-30。洗脱用溶剂系统要通过薄层层析进展筛选。但因薄层层析时吸附剂的外表积一般为柱层析时外表积的 2 倍左右，故一般薄层层析展开时使组分 Rf 值到达的溶剂系统可选用为柱层离该相应组分的最正确溶剂系统。在整个层析过程中，层析柱吸附剂上面应始终保持有洗脱剂，一旦洗脱剂低于吸附剂，则带进大量空气，影响别离效果，甚至使层析过程失败。干法上样时

26、，样品一定要呈溶液状态拌入吸附剂，如样品没有完全溶解，将混悬液拌入吸附剂，当进展柱层析时，颗粒状样品在洗-脱剂作用下，逐步溶解后再经柱层析移动，用薄层层析检查时，样品完全没有别离开。(三)反相硅胶层析 最常用的 Lobar 柱。柱层析的填料系将普通硅胶经化学修饰，键合上长度不同的烃基(R)，形成亲油外表而成。一般根据键合的烃基长度为乙基、辛基、十八烷基。分别命名为 RP(reverse phase)-2、RP-8 及 RP-18。三者亲脂性强弱为 RP-18RP-8RP-2。Lobar 柱属于低压柱层析*畴(5 个大气压)。具有上样量大、别离速度快、别离效果好，价格也比拟廉价，操作简便，可反复

27、使用的优点。国内使用的单位也比拟多。适用于皂苷、多肽及其它多糖苷等水溶性成分的别离。现在国内也有反相硅胶商品出售，也可直接按常压柱层析操作使用。为了提高别离速度，缩短别离时间，可使用加压液相层析(始于经费问题，还远没有普及)。依据所用压力大小不同，可以分为快速层析(5 个大气压)，低压液相层析(LPLC，20 个大气压)等。(四)聚酰胺层析 聚酰胺的种类很多，但用于层析的有两种：绵纶 6(聚已内酰胺)和锦纶 66(聚已二酰已酰胺)，它们既亲水又亲脂，其亲水、亲脂性能较好。因此，既可别离水溶性物质，又可别离脂溶性物质。聚酰胺吸附原理是由于聚酰胺分子内有很多酰胺键，可与酚酸类、醌 类、硝基化合物等

28、形成氢键。因而对这些物质产生了吸附作-用即氢键吸附。酚酸类是其酚羟基和羧基与聚酰胺的羰基形成氢键。芳香硝基化合物和醌类是其硝基和醌基与聚酰胺分子中酰胺键的游离氨基形成氢键。聚酰胺层析是一种用途十分广泛的别离方法，特别适合于别离酚类、醌 类、黄酮类等化合物。聚酰胺吸附强弱主要取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力，要含水溶剂中大致有以下规律：形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。如丁二酸丁酸；间苯三酚间苯二酚苯酚。形成氢键的位置对吸附力有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。如间苯二酚苯酚邻苯二酚；对羟基苯甲酸邻羟基苯甲酸。分子中芳香化程度高者，则吸附作用增强，反之，则减弱。如 与溶剂介质有关，一般认为，在水中形成氢键能力最强，在有机溶剂中较弱，大碱性溶剂最弱。因此，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，大致排列成以下顺序：水不浓度的甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化铵或氢氧化钠甲酰胺二甲基甲酰胺茛菪碱东茛菪碱。因此，先用水洗下东茛菪碱；继用氯化铵NH4Cl洗下茛菪碱；最后用碳酸钠Na2CO3洗下小檗碱。此外，离子交换层析还可用于有机酸、酸性物质、氨基酸的提取别离。