各种酶切位点的保护碱基37277.pdf

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1、各种酶切位点的保护碱基 酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出 3 个 碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加 3 个碱基做保护。寡核苷酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采用了一系列含识别序列的 短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头 上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中

2、没有列出的酶，则通 常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用Y32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A 260单位的寡核苷酸。取 1 Q 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20 C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液 含 70 mM Tris-HCI（pH 7.6）,10 mM MgCI 2,5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCI（视酶的具体要求而 定）。20%的PAGE（7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可

3、能因为出现 发夹结构而降低。1 1酶 寡核苷酸序列 链长 切割率%2 hr 20 hr Acc I G GTCGAC C 8 0 0 CG GTCGAC CG 10 0 0 CCG GTCGAC CGG 12 0 0 Afl III CACATGT G 8 0 0 CCACATGT GG 10 90 90 CCC ACATGT GGG 12 90 90 Asc I GGCGCGCC 8 90 90 AGGCGCGCC T 10 90 90 TTGGCGCGCC AA 12 90 90 n Ava I CCCCGGG G 8 50 90 CC CCCGGG GG 10 90 90 TCC CCC

4、GGG GGA 12 90 90 BamH I CGGATCC G 8 10 25 CG GGATCC CG 10 90 90 CGC GGATCC GCG 12 90 90、Bgl II CAGATCT G 8 0 0 GAAGATCT TC 10 75 90 GGA AGATCT TCC 12 25 90 1 BssH II GGCGCGC C 8 0 0 AG GCGCGC CT 10 0 0 TTG GCGCGC CAA 12 50 90 BstE II G GGT(A/T)ACC C 9 0 10 BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGG 22 0 0 AAAAC

5、TGCAG CCAATGCATTGG AA 24 25 50 CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT 27 25 90 Cla I CATCGAT G 8 0 0 GATCGAT C 8 0 0 CC ATCGAT GG 10 90 90 CCC ATCGAT GGG 12 50 50 EcoR I G GAATTC C 8 90 90 CG GAATTC CG 10 90 90 CCG GAATTC CGG 12 90 90 厂 Hae III GG GGCC CC 8 90 90 AGC GGCC GCT 10 90 90 TTGC GGCC GCAA 12 90 90

6、Hind III CAAGCTT G 8 0 0 CC AAGCTT GG 10 0 0 CCC AAGCTT GGG 12 10 75 1 Kpn I GGGTACC C 8 0 0 GG GGTACC CC 10 90 90 CGG GGTACC CCG 12 90 90 Mlu I GACGCGT C 8 0 0 CGACGCGT CG 10 25 50 i Nco I CCCATGG G 8 0 0 CATG CCATGG CATG 14 50 75 Nde I CCATATG G -8 0 0 CC CATATG GG 10 0 0 CGC CATATG GCG 12 0 0 GGG

7、TTT CATATG AAACCC 18 0 0 GGAATTC CATATG GAATTCC 20 75 90 GGGAATTC CATATG GAATTCCC 22 75 90 Nhe I GGCTAGC C 8 0 0 CG GCTAGC CG 10 10 25 CTAGCTAGC TAG 12 10 50 Not I TTGCGGCCGC AA 12 0 0 ATTT GCGGCCGC TTTA 16 10 10 AAATAT GCGGCCGC TATAAA 20 10 10 ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT 24 25 90 AAGGAAAAAA GCGGCCGC

8、 AAAAGGAAAA 28 25 90 Nsi I TGC ATGCAT GCA 12 10 90 CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT 22 90 90 Pac I TTAATTAA 8 0 0 GTTAATTAA C 10 0 25 CC TTAATTAA GG 12 0 90 Pme I 8 0 0 GTTTAAAC GGTTTAAAC C 10 0 25 GG GTTTAAAC CC 12 0 50 AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG 24 75 90 Pst I GCTGCAG C 8 0 0 TGCA CTGCAG TGCA 14 10 10 AAC

9、TGCAG AACCAATGCATTGG 22 90 90 AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA 24 90 90 CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT 26 0 0 Pvu I CCGATCG G 8 0 0 ATCGATCG AT 10 10 25 TCG CGATCG CGA 12 0 10 L Sac I CGAGCTC G 8 10 10 Sac II GCCGCGG C 8 0 0 TCC CCGCGG GGA 12 50 90 Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC 28 0 0 GC GTCGAC GTCTTGG

10、CCATAGCGGCCGCGG 30 10 50 ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 32 10 75 Sca I GAGTACT C 8 10 25 AAAAGTACT TTT 12 75 75 r Sma I CCCGGG 6 0 10 CCCCGGG G 8 0 10 CC CCCGGG GG 10 10 50 TCC CCCGGG GGA 12 90 90 Spe I GACTAGT C 8 10 90 GG ACTAGT CC 10 10 90 CGG ACTAGT CCG 12 0 50 CTAG ACTAGT CTAG 14 0 50 Sph I

11、 GGCATGC C 8 0 0 CAT GCATGC ATG 12 0 25 ACAT GCATGC ATGT 14 10 50 Stu I AAGGCCT T 8 90 90 GA AGGCCT TC 10 90 90 AAAAGGCCT TTT 12 90 90 Xba I CTCTAGA G 8 0 0 GC TCTAGA GC 10 90 90 TGC TCTAGA GCA 12 75 90 CTAG TCTAGA CTAG 14 75 90 Xho I CCTCGAG G 8 0 0 CC CTCGAG GG 10 10 25 CCG CTCGAG CGG 12 10 75 Xma

12、 I CCCCGGG G 8 0 0 CC CCCGGG GG 10 25 75 CCC CCCGGG GGG 12 50 90 TCCC CCCGGG GGGA 14 90 90 2.双酶切的问题 参看目录，选择共同的 buffer。其实，双酶切选哪种 buffer 是实验的结果，takara 公司从 1979 年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切 buffer 完全是依据具体实验结果得到的。有共同 buffer 的，通常按照常规的酶切体系，在 37 C进行同步酶切。但 BamH I 在 37 C下有时 表现出 star 活性，常用 30 C单切。

13、两个酶切位点相邻或没有共同 buffer 的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶 切。3.酶切底物 DNA，切不开 1）底物 DNA 上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。2）PCR 引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR 产 物酶切前尽量进行精制以更换 buffer。由于 PCR 产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常 PCR 产物的添加量占总反应体积 25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的 DNA，同样量，用不同的限制酶切情况 可能不同，由于 DNA 的空间结构造成的。同样的 DNA，

14、不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液体状态，都是根据最佳反应体系配制了浓度，不可以再用 buffer 稀释，因为酶浓度和活性之间不呈直线对应关系，酶浓度越稀，相对活性越低，并且越不稳定，有时便会 出现底物 DNA 不能被切断的现象。不同公司的酶和 buffer 不要交叉使用，否则可能会影响酶切效果。5）酶的识别位点上的碱基被甲基化。可以选用不受甲基化影响的同裂酶，或将质粒 DNA 转入甲基 化酶欠损的宿主菌中，重新制备 DNA，也可以使用 PCR 的方法对 DNA 进行扩增，再做酶切。常用 的有 XbaI 容易受甲基化影响，通常选用

15、 GM33 做宿主菌转化。6）底物不纯，含有限制酶阻害物质，影响酶切作用，需要重新纯化 DNA。一般做乙醇沉淀纯化即 可。如果质粒中含盐或酚等，都会影响酶切效果。4.DNA 经酶切后，电泳无带或出现 smear 现象 DNA 或酶切试剂中混有 DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发 DNase 的作用，将 DNA 降解。可以用 DNA 上的其他酶，也可以用此酶切其他 DNA 来检查问题所在。如果质粒酶切出现此 情况，首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。5.甲基化酶 M.Alu I,M.Bam H I,M.RcoR I 不属于 CG 甲基化，dam 甲基化，也不属于 dcm 甲基化。甲基化酶作用后，DNA 不能被相应的酶切断。