土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸11504.pdf

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1、-土壤微生物生物量的测定方法 1 土壤微生物碳的测定方法熏蒸提取-仪器分析法 1.1 根本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后24h，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的 0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数KEC，从而计算土壤微生物生物量碳。1.2 实验仪器 自动总有机碳TOC分析仪Shimadzu Model TOC500,JANPAN、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂 1无乙醇氯仿CHCL3；20.5mol/L 硫酸钾溶液：称取

2、87g K2SO4溶于 1L 蒸馏水中 3工作曲线的配制：用 0.5mol/L 硫酸钾溶液配制 10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L 系列标准碳溶液。其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理过筛和水分调节略 1.4.2 熏蒸 称取新鲜相当于干土 10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定3 份分别放-入 25ml 小烧杯中。将烧杯放入真空枯燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿 约 2/3的 15ml 烧杯 2 或 3 只，烧杯放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有 NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放

3、出来的 CO2，枯燥器底部参加少量水以保持容器湿度。盖上真空枯燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾 5 分钟。关闭真空枯燥器阀门，于25黑暗条件下培养 24 小时。1.4.2 抽真空处理 熏蒸完毕后，翻开真空枯燥器阀门应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做，取出盛有氯仿可重复利用和稀 NaOH 溶液的小烧杯，清洁枯燥器，反复抽真空5 或 6 次，每次 3min，每次抽真空后最好完全翻开枯燥器盖子，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的 3 份土壤，置于另一枯燥器中为不熏蒸对照处理。注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提 1.4.4 浸提过滤 从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到

4、80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，4g 土：16ml 的硫酸钾溶液，当然这个参加量要根据 TOC 仪器的进入量决定300r/min 振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀 注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1

5、元。1.4.5 TOC 仪器测定-吸取上述土壤提取液 10ul这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进展稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。注入自动总有机碳TOC分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪Shimadzu Model TOC-500,JAPAN为例。1.5 计算 SMBC=(ECCHCL3ECCK)*TOC 仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.45 2 土壤微生物生物量氮茚三酮比色法 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的 2%7%，是土壤

6、中有机无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 2.1 根本原理茚三酮比色法 Amato 和 Ladd1988研究说明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反响定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反响态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮FE-Nnin。2.2 实验仪器 分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等 2.3 实验试剂-1无乙醇氯仿CH

7、3Cl；20.5mol/L(K2SO4)溶液：称取硫酸钾K2SO487g，溶于去离子水中，稀 释至 1000ml；3pH5.2 的乙酸锂LiOHH2O溶液：称取氢氧化锂LiOHH2O168g，加 入冰乙酸优级纯279ml，加水稀释到 1000ml，用浓盐酸或 50%氢氧化钠溶 液调节 pH 至 5.2。4茚三酮溶液：取 150ml 二甲基亚砜C2H6OS和乙酸锂溶液 50ml 参加4g 水 合茚三酮C9H4O3H2O和 0.12g 复原茚三酮C18H10O62H2O搅拌至完全 溶解；550%乙醇水溶液：吸取 50ml 99%乙醇于 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容；6 1mol/L 的硫酸铵

8、(NH4)2SO4标准储存液：称取 4.7167g 分析纯硫酸铵 称 前 105烘 2h溶于 0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，摇匀，于 4冰箱中保存。70.1mol/L 的硫酸铵(NH4)2SO4标准液：吸取 10ml 1mol/L 的硫酸铵标准 储存液于 100ml容量瓶中，用 0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此-溶液最好现配现用。8工作曲线的制备：分别吸取 0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、mol/L 的硫酸铵标准液于 100ml 容量瓶中，用 0.5mol/L 硫酸钾溶液 定容至 100

9、ml，摇匀，其浓度分别为 0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L 硫酸铵标准氮的系列溶液。2.4 操作步骤 2.4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样 2.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样 2.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样 2.4.4 浸提过滤 从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 2g，即，2g 土：8ml 的硫酸钾溶液300r/min 振荡30min，用

10、中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀 注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元。2.4.5 分光光度计比色测定此处沸水浴不好控制-吸取 0.5ml 样品提取液和标准工作液，分别置于 10ml 的塑料离心管中，参加 2ml 茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却冰浴约2min，参加 5ml 稀释液

11、50%乙醇水溶液，摇匀于 570nm 下比色。2.5 结果计算 SMBN=(ECCHCL3ECCK)*稀释倍数*原来的水土比*5 土壤微生物生物量氮的测定全氮测定法,建议使用此法 注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本 2.4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样 2.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样 2.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样 2.4.4 浸提过滤 从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到 80ml 聚乙烯离心管中，参加 40ml 0.5mol/L 硫酸钾溶液土水比为 1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为 4g，即，2g 土：1

12、6ml 的硫酸钾溶液300r/min 振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或20冷冻保存但使用前需解冻摇匀 注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在20，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个 0.2um 的滤头，一个才 1 元。2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定-吸取 10ml 滤液与消煮管中，参加 K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g，参加 4ml 浓硫酸；同时设置 23 空白10ml 的 0.5mol/l

13、的 K2SO4，参加K2SO4CuSO4Se 混合催化剂 1.08g，参加 4ml 浓硫酸；在高温消化 340消煮 3 个小时至澄清后放置 2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。2.5 结果计算 EN=(VS-VO)*CH2SO4*14*1000*(16/10)WS 式中：EN为全氮，VO为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积注意：消煮一批土样至少需要 3 个对照，VS为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，CH2SO4为硫酸浓度 这个浓度要进展标定的，具体见农化分析课本，14 为氮的摩尔质量，1000 为千克转化成克，16/10 为从 16ml 的提取液中吸取 10ml，WS为干土重

14、所以：土壤微生物生物量氮 Bn=(ENCHCL3ENCK)/0,54 见?土壤微生物研究原理与方法?，主编：林先贵 中科院土壤研究所 3 土壤微生物生物量磷无机磷测定法 Brookes 等1982报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大局部为无机磷酸盐，可被 0.5mol/LNaHCO3 等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的上下。于是，Brookes 等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取-无机磷测定法。3.1 根本原理 新鲜土壤经氯仿熏蒸后24h，采用 0.5mol/LNaHCO3溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸

15、络合形-成磷钼杂多酸 在一定酸度条件下，可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数kp，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、局部吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括*些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的畴不一样，不要搞混 以及外加无机磷的回收率Rpi作为校正系数，从而估算土壤微生物生物量磷。3.2 实验设备 分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等 3.3 实验试剂 1无乙醇氯仿CH3Cl；20.5

16、mol/L 碳酸氢钠NaHCO3浸提液：溶解 NaHCO342.0g 于 800ml水中，以 0.5mol/LNaOH 溶液调节浸提液的 pH 至 8.5，再用蒸馏水稀释至 1000ml。此溶液曝于空气中可因失去 CO2而使 pH 增高，可于液面加一层矿物油保存。此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，假设储存超过一个月，应检查 pH 是否改变；3磷酸二氢钾溶液【pKH2PO4=250 ug p/ml】：称取 1.0984g 分析纯磷酸二 氢钾称量前 105烘 23h，溶于去离子水并定容至 1000ml；-4钼锑抗试剂：间鲍士旦的土壤农化分析课本 5磷标准液：准确称取在 105烘箱中烘干的

17、KH2PO4分析纯0.2195g，溶 解在 400ml 水中，加浓硫酸 5ml加硫酸放置霉菌，可是溶液长期保存，转 入 1000ml 容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液为 50ug/ml 磷标准液。吸取上 述磷标准液 25ml，定容至 250ml，即得 5ug/mL 磷标准液此溶液不可久存 6工作曲线：准确吸取 5ug/ml 磷标准液 0、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml 分别放入 25ml 容量瓶中，加水至约 20ml，然后加钼锑抗试剂 4ml，最后用水定容至 25ml。30min 后开场进展比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0ug/ml、0.1 ug/ml、0.2 ug/ml、

18、0.4 ug/ml、0.6 ug/ml、0.8 ug/ml、1.0 ug/ml磷。3.4 操作步骤 3.4.1 土壤的前处理和 1.4.1 一样 3.4.2 熏蒸和 1.4.2 一样 3.4.3 抽真空处理和 1.4.3 一样 3.4.4 浸提过滤 从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到250ml 聚乙烯提取瓶中，参加 200ml 0.5mol/L NaHCO3浸提液土水比为 1:20，考虑到土样的缺乏，这个局部称取 2g 土，比值为 2g 土：40ml NaHCO3，300r/min 振-荡 30min，用慢速定量滤纸过滤。同时作 3 个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或2

19、0冷冻保存但使用前需解冻摇匀。3.4.5 无机磷的回收率很重要 另称取经前处理相当于干土 2.0g 土样 2 份，分别放入三个 50ml 聚乙烯提取瓶，参加 0.2ml 250 ug p/ml 磷酸二氢钾溶液，再参加 40ml 0.5mol/L碳酸氢钠NaHCO3浸提液，同上进展提取。用于测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率Rpi，以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附和固定。土壤提取液也立即分析，或 20冷冻保存但使用前需解冻摇匀。3.4.6 分光光度计比色测定 吸取 10ml 提取液依样品的含磷而定于 25ml 容量瓶中，参加适量的1.0mol/LHCl溶液进展中和，HCl 溶液

20、的参加量通常为提取液体积的1/2，放置 4h 并间隙振荡，以排除溶液中的CO2。补充去离子水至20ml，参加 4ml混合显色剂，再加水定容，摇匀。显色完全约30min 后，在 882nm 波长处进展比色。3.5 结果计算 土壤微生物生物量磷 BP=Ept/Kp*Rpi单位为 mg/kg 式中 Ept 为熏蒸和未熏蒸的土壤差值，即：(EPCHCL3EPCK),EPCHCL3EPCK=W1(分光光度计的值)*2.5(容量瓶的稀释倍数)*4 40nl 浸提液中取 10ml*20水土比，Rpi=(外加 KH2PO4溶液土壤的测定值未熏蒸土壤的差值)/25*100%,其测定和算法也是和 EPCHCL3EPCK一样；Kp 为转化系数，取值为 0.4