T_SHRH 021-2019 化妆品美白功效测试 体外重组3D黑色素模型 测试方法.docx

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1、T/SHRH021-2019目次前言21范围32.规范性引用文件33.术语和定义34.试验原则.35.试剂及仪器设备46.试验步骤47.结果计算58.质量控制69.结果判定6附录A:（资料性附录）71T/SHRH021-2019化妆品美白功效测试体外重组3D黑色素模型测试方法1范围本标准规定了一种基于体外重组3D黑色素模型的化妆品原料及化妆品成品的美白功效测试方法。本标准可作为化妆品美白功效测试替代方法之一，也可结合其他方法对化妆品美白功效进行评价。本标准适用于具有生物化学美白作用的化妆品原料及成品的美白功效测试，不适用于物理遮盖类美白原料或成品。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不

2、可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法化妆品安全技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1体外重组3D黑色素皮肤模型invitroreconstructedhumanskincontainingmelanocytes采用人原代表皮角质形成细胞及黑素细胞共培养形成的一种复层化、高度分化的三维重建皮肤模型。该类模型需对外界刺激（UVB、-MSH、ET-1等）具有黑化响应，及对美白剂（曲酸等）具有美白响应。3.2吸光度opticaldensity,OD入射

3、光强度与透射光强度比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。4试验原则4.1方法简要步骤本标准采用体外重组3D黑色素模型（MelaKutis）对具有生物化学美白机理的化妆品原料及成品进行美白功效性测试。化妆品原料采用液下给药方式，在气液面培养的第6天（TA6）开始给药，连续给药6次，单次孵育时长为24h。化妆品成品采用表面给药方式，在模型气液面培养第6天（TA6），第8天（TA8）进行2次给药，剂量为10L/次，单次给药后孵育时长为48h。待测物给药、孵育全部结束后，去除待测物残留，对暴露后的体外重组3D黑色素模型进行表观色度，L*

4、值，黑色素分布及黑素含量等测试。4.2方法测试终点生物化学美白主要通过抑制黑色素的合成、阻断黑色素的转运及加快黑色素的代谢等机制达到美白功效。体外重组3D黑色素皮肤模型（MelaKutis）具有类似天然皮肤的黑化和美白响应能力，在化3T/SHRH021-2019妆品原料或成品暴露后，通过如下四个测试终点评价受试物美白功效。其中，表观色度与L*值用于测定待测物的亮白作用；黑素颗粒分布用于测定待测物的黑素转运抑制作用；黑素含量用于测定待测物的黑素合成抑制作用。5试剂及仪器设备5.1材料及试剂5.1.1体外重组3D黑色素皮肤模型（MelaKutis）。5.1.2体外重组3D黑色素皮肤模型培养液（M-

5、TA培养液）。5.1.3PBS缓冲液。5.1.4曲酸（KojicAcid，KA）。5.1.5二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）。5.1.6乙醇。5.1.7乙醚。5.1.8氢氧化钠（NaOH）。5.1.9丙二醇。5.1.10黑素标准品（CAS号：29512-49-0）。5.1.11多聚甲醛（4%）。5.1.12Masson-Fontana黑色素染色试剂盒。5.2仪器设备5.2.1UVB辐照仪：50mJ/cm2。5.2.2酶标仪：405nm。5.2.3超净工作台。5.2.4CO2细胞培养箱：371，51%CO2，95%相对湿度。5.2.5分析天平(精度0.1mg)。5.2.

6、6移液器：连续加样器和相应吸头、M25活塞排代式移液器和相应吸头、2L10L、10L100L、20200L、1001000L移液器及相应吸头。5.2.7通风柜。5.2.8电热恒温水浴锅（80）。5.2.9单反相机。5.2.10色度仪。5.2.11正置显微镜。5.2.12低温高速离心机。6试验步骤6.1体外重组3D黑色素皮肤模型的准备该步骤在超净工作台中进行。每轮测试中，空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和各待测物组均需要1块6孔板。标记6孔板，在每个孔中加入3.7mL的M-TA培养液，并放入无菌悬架，将气液面培养3天（TA3）的体外重组3D黑色素皮肤模型转移至无菌悬架中，置于CO2培养箱中培养

7、（371、51%CO2、95%相对湿度）。每组需用6个模型，其中表观色度、黑素颗粒分布测定需3个重复模型；L*值、黑素含量测定需3个重复模型。6.2UVB诱导4T/SHRH021-2019阳性对照组、阴性对照组、待测样品组自TA3开始，连续进行7天UVB辐照，辐照剂量为50mJ/cm2/次。每次辐照结束后，更换培养液，液量为3.7mL/孔。空白对照组不进行UVB辐照，每天仅更换培养液，液量为3.7mL/孔。6.3给药6.3.1化妆品成品给药方式在气液面第6天（TA6）和气液面第8天（TA8）进行表面给药，给药量为10L。阳性对照选用曲酸，给药浓度为0.05%。6.3.2化妆品原料给药方式从气液

8、面第6天（TA6）开始每天进行液下给药，共6次，给药间隔时间为24h。阳性对照组每孔添加含42.67g/mL曲酸的M-TA培养液；待测物每孔添加含一定浓度受试物的M-TA培养液。阴性对照组、空白对照组仅更换培养液。6.4清洗：化妆品成品给药全部结束后，采用超纯水对皮肤模型表面清洗三次，去除受试物残留。化妆品原料类给药全部结束后，用无菌棉签擦拭皮肤模型底面，去除受试物残留。6.5检测6.5.1表观色度将比色卡置于单反相机正下方，用镊子将单个模型放置于比色卡色圈内，进行拍照。单反相机参数设置为手动拍照模式，焦距调至5.8mm，孔径设置为f/8，光圈调至F22，快门速度设置为1/80s，ISO设置为

9、1600。6.5.2L*值测定用手术刀片沿模型边缘进行环切后，用干净的镊子置于相片纸上，保证角质层朝上放置；色差仪自校后，将色差仪检测孔垂直按压于模型表面进行三次读数，取平均值作为单个模型的L*值最终读数。6.5.4黑素颗粒分布测定将表观色度拍照结束后的模型，用手术刀片沿模型边缘进行环切后，放入装有4%多聚甲醛溶液的1.5mL离心管中，固定2h。采用乙醇脱水、二甲苯透明后，进行石蜡包埋，切片（厚度58m）。二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化结束后，根据Masson-Fontana黑色素染色试剂盒说明书进行染色，封片后，置于正置显微镜下40倍物镜下拍照，观察黑素颗粒分布。6.5.3黑色素含量检测将L*值测

10、定后的模型置于1.5mL离心管中，加入1mLPBS缓冲液，涡旋振荡仪震荡3min，低温高速离心机2000r/min离心10min，弃上清；向1.5mL离心管中依次加入200L蒸馏水，500L无水乙醇和500L乙醚，充分混匀后，室温静置20min，3000r/min离心5min，弃上清；加入1mL含10%DMSO的1mol/LNaOH水溶液，80水浴中加热40min，用移液器吸取200L至96孔板中，酶标仪405nm波长下读取OD值。7结果计算5T/SHRH021-20197.1L*值根据每组三个重复模型的L*值，计算平均值（Mean）及标准差（StandardDeviation，SD），结果采

11、用MeanSD形式表示。7.2黑素含量以黑色素标准品的浓度为纵坐标，OD值为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程式，将测定的OD值代入回归方程式，计算黑素含量。计算每组三个重复模型的黑素含量平均值及标准差，结果采用MeanSD形式表示。7.3黑素颗粒分布每个模型选3个区域，于40X镜下拍照，用图像分析软件（如ImageJ等）计算黑色素颗粒面积。8质量控制8.1基本原则：每批次试验均需设置空白对照、阴性对照和阳性对照。实验中设置的各种对照应符合以下标准。如任一种对照出现非下述标准，则视为质控不合格。8.2阴性对照：与空白对照组相比，表观色度呈现明显黑化，L*值呈现10%以上下降，黑素含量呈现10%

12、以上升高、黑素分布呈现明显升高，且具有统计学差异。每组中，三个重复模型的L*值与黑素含量标准偏差均小于等于15%。8.3阳性对照：与阴性对照组相比，表观色度呈现明显变白，L*值呈现10%以上升高，黑素含量呈现10%以上下降、黑素分布呈现明显下降，且具有统计学差异。每组中，三个重复模型的L*值与黑素含量标准偏差均小于等于15%。8.4待测样品：三个重复模型的L*值与黑素含量标准偏差均小于等于15%。9结果判定以下条件说明待测物具有美白功效:与阴性对照组相比，待测物表观色度明显变白，L*值具有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物黑色素颗粒分布减少，且有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物黑色素含量降低，且有统计学显著性差异；如待测物有部分指标满足上述条件，仍可说明待测物具有美白功效。_6T/SHRH021-2019附录A（资料性附录）图A.1体外重组3D黑色素模型实物图角质层颗粒层棘层基底层黑色素细胞图A.2体外重组3D黑色素模型Masson-Fontana染色图片7