生物药物分离纯化技术实验指导28902.pdf

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1、实验一 蔗糖密度梯度离心分离实验 一、实验目的 1.熟悉蔗糖密度梯度离心原理 2.熟练掌握蔗糖密度梯度离心操作技术 二、实验原理 溶液的密度自上而下逐渐变化的分布状态称为密度梯度。在超速离心技术中，样品的密度应该分布在溶液的密度梯度范围内。三、材料、试剂及仪器 1.试剂 20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液；墨汁。2.仪器 烧杯，普通离心机，试管若干。四、实验步骤 1.梯度液的制备（1）制备出不同浓度的蔗糖溶液，浓度间隔相同，分别是浓度为 20%、40%、60%、80%的蔗糖溶液。（2）每个浓度量取相同的体积，按浓度依次减小的顺序逐个缓慢铺入离心管中，制成不连续阶梯密度梯度。（3）此离心管

2、在 20-25静止 2-3h，通过重力作用即成接近线性的蔗糖密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至 0.5-1h。温度低时所需静置的时间较长，温度高的时候则较短。为减少对流，静置后应将离心管置于冰浴中备用。2.蔗糖密度梯度离心 向已形成密度梯度的离心管中加入半滴墨汁，加入离心管中离心，3000r/min离心10min，观察实验现象。五、结果与分析 蔗糖密度梯度离心和差速离心有什么区别？实验二 双水相相图的制备 一、实验目的 1.了解双水相萃取的原理和发展历史、趋势 2.掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法 二、实验原理 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且

3、在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。相图是一根双节线，当成相组分的配比在曲线的下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；当配比在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比在曲线上，混合后，溶液恰好由澄清变为浑浊。连接双节线上的两点的直线称为系线，它由三点确定,即 M(初始混合物组成情况)、T(上相组成情况)、B(下相组成情况)，其中T/B 互为共扼相。系线越长，两相间的差别越大，当系线长度趋向零时，两相差别消失。系线上系统的总浓度不同，但均分成

4、组成相同体积不同的两相，两相体积服从杠杆规则：三、材料、试剂及仪器 1.试剂 PEG400；硫酸铵。2.仪器 漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平。四、实验步骤 1.双水相系统的制作（1）精确配制 43%（g/ml）的(NH4)2SO4溶液，并测定其密度。（2）精确称取 PEG400 液体 0.7g 于试管中，按表格中所列第一号数据，用吸管加入 0.5毫升水，缓慢滴加已配制好的(NH4)2SO4溶液，并在混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现浑浊为止，记录(NH4)2SO4的加入量，根据密度求出重量。（3）按下表列出的第 2 号数据加入水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2

5、SO4溶液，使其再次达到浑浊。如此反复操作，计算每次达到浑浊时 PEG400 和(NH4)2SO4在系统总量中的百分含量。序加水量 加(NH4)2SO4纯(NH4)2SO4纯(NH4)2SO4溶液累计PEG400(NH4)2SO4号（ml）溶液量（ml）新增量（g）累积量（g）总量（ml）重量百分比 重量百分比 1 2 3 4 5 6 7 2.相图的绘制 以 PEG400 的重量百分比浓度为纵坐标，(NH4)2SO4的重量百分比浓度为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。五、注意事项 1.微量滴定管在使用前必须先洗涤干净，否则容易产生气泡或发生堵塞现象。洗涤时，不用去污粉，可用铬酸洗液或洗涤液先

6、浸泡一段时间后，用一根细长的刻度移液管刷刷洗刻度处，最后用蒸馏水反复冲洗数次。2.清洗干净的微量滴定管必须先用蒸馏水试漏，如有漏液，可涂少量凡士林（过量的凡士林会堵塞滴定管）。试漏成功的滴定管要润洗两次，即注液杯、支管、刻度管和出液尖嘴用滴定液洗涤两遍。3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4 滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。六、思考问题 1 双水相萃取中相图有何意义？2 双水相萃取在分离生物大分

7、子物质时有何意义？实验三 牛血清蛋白在双水相萃取系统中的分配 一、实验目的 1.了解双水相萃取的原理和方法 2.双水相系统分离蛋白质的操作 二、实验原理 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分占很大比例，即形成双水相。常见的双水相系统可分为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，它是研究双水相萃取的基础。双缩脲反应是指蛋白质在碱性溶液中与而家铜离子结合生成紫色络合物的反应，双锁尿是由两分子尿素缩合而成的化合物在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红和络合物。因此具有两个或两个以上的肽键的化合物都有双缩脲反应，其颜色深浅和蛋白质含

8、量成正比。可利用此反应进行蛋白质定性鉴别（4）材料、试剂及仪器 1、材料 牛血清蛋白 2 .试剂 Peg6000、硫酸铵、硫酸铜、酒石酸钠钾、氢氧化钠、蒸馏水。2.仪器 离心机、离心管、烧杯、玻璃棒、量筒、天平。四、实验步骤 1.双水相系统的制作（1）配制牛血清蛋白溶液：1g/L（2）配制高浓度的聚合物和盐溶液母液：PEG6000，400g/L、硫酸铵 400g/L 各 20ml。（3）配制相应的高聚合物子液（60 g/L,100 g/L,140 g/L）和盐的子液（140 g/L,140 g/L，140 g/L）各 4ml（4）将高聚合物子液和盐的子液转到 10ml 离心管中，加入牛血清蛋白

9、 2ml，共三组。离心管封口后，反复倒置 5-10min，6-10 次/分钟。使充分混合。（5）1500R/min 下离心 3-5min 后，观察情况。（6）小心吸取目标物，加入双缩脲试剂进行定性鉴定。五、注意事项 1.离心前，必须配平。3.由于支管拐弯处易藏气泡，一般待滴定液放满刻度管后打开支管旋塞用洗耳球将溶液中气泡刚好吹入贮液杯中即可，也可缓慢倾斜滴定管使气泡从口部溢出。4.滴定过程要注意爱护仪器，轻拿轻放。用(NH4)2SO4 滴定时，在接近滴定终点左右时一定要每滴一滴，便彻底混匀后方可滴定下一滴。六、思考问题 1 双水相萃取蛋白的优点。2 双水相萃取成相的影响因素有哪些？实验四 机械

10、剪切法细胞破碎实验及 PPO 的粗提 一、实验目的 1.熟悉细胞破碎的基本方法 2.熟练掌握机械破碎法操作技术 二、实验原理 细胞破碎技术（包括机械破碎法：捣碎法、珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法；非机械破碎法：冻结-融化法、渗透压冲击法、有机溶剂法、表面活性剂法、酸碱法、酶溶法）是提取分离生物药物的一个基本技术，是一项必须掌握的基本技能）。三、材料、试剂及仪器 1.材料：土豆 2.试剂（1）0.1mol/L 的 NaF 溶液（4.2gNaF 溶于 1000ml 水中）；（2）0.1mol/L 的邻苯二酚溶液（1.1g 邻苯二酚溶于 1000ml 水中，用稀 NaOH 调节溶液 pH为 6.0

11、）。3.仪器 家用匀浆机，烧杯，布氏漏斗，抽滤瓶，量筒，容量瓶，普通离心机，水浴锅，不锈钢锅。四、实验步骤 1.酶抽提物的制备（1）拿一块土豆，洗去上面的泥土；（2）去土豆皮后切成小块；（3）称取 50g 土豆块放入匀浆机中，再加入 50ml 氟化钠溶液；（4）在匀浆器中研磨 30s；（5）把匀浆物通过几层细布滤到一个 100ml 的烧杯中；（6）加入等体积的饱和硫酸铵溶液（70g 硫酸铵溶于 100ml 水，加热到 70-80使其溶解，冷却到室温后过滤，即得饱和硫酸铵溶液），混合后于 4放置 30min；（7）在 4000r/min 下离心 15min，倒掉上清液；（8）将沉淀物用大约 15

12、ml 柠檬酸缓冲液（pH=5.6，将 0.1mol/L 的 A 液柠檬酸和 0.1mol/L的 B 液柠檬酸三钠按 5.5：14.5 的比例混合），既得该酶粗制品。2.多酚氧化酶的颜色反应（1）将 3 只干净的试管编号为 1、2、3.（2）按下面的要求制备各管：管号 酶抽提液 水 邻苯二酚（0.01mol/L）混合均匀 1 15 滴 15 滴 2 15 滴 15 滴 3 15 滴 15 滴（3）把三只试管放于 37水浴（4）每隔 5min 震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化，共反应 25min。（5）观察现象，记录实验结果。五、结果与讨论（1）记录以上实验过程每一步骤的现象，并对现象所说明的问

13、题进行分析。（2）本实验中加入硫酸铵的目的是什么？（3）预测试管 1、2、3 的现象，并说明预测的依据。实验五：高压匀浆法、珠磨法细胞破碎技术 一、实验目的：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波等方法。本实验主要介绍高压匀浆法、珠磨法的介绍和使用。二、实验原理：1 高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压使

14、细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。1.1 高压匀浆机工作原理及工作示意图 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式

15、，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在 20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。1.2 高压匀浆破大肠杆菌 菌体浓度 150gL-1 左右(目标蛋白表达量为 20%)用去离子水悬浮，在 80MPa 压力下，连续高压匀浆三次。影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，工业生产中常采用的压力为 5570Mpa。高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状

16、或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。2、珠磨法：设备是珠后机，其破碎机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失 30左右。三、实验操作 两种机器的使用过程及步骤。实验六 红霉素的萃取与精制 一、实验目的（1）学会利用溶剂萃取的方法对微生物药物的原理与方法进行提纯；（2）掌握利用提取红霉素的步骤和操作要求。二、实验

17、原理 萃取过程是利用混合物质各种组分在两个不相混溶的液相中的溶解度的不同，从而达到分离的目的。红霉素在碱性条件下，溶于乙酸乙酯中，在酸性条件下溶于水溶液中给，通过这个原理达到分离提纯的目的。三、试剂及仪器 1.材料 2g 红霉素软膏。2、器材 量杯、烧杯、布氏漏斗及抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架台、剪刀、烘箱等。2.试剂 乙酸、乙酸乙酯、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（10g 醋酸钾溶于 100ml 无水乙醇中，现用现配）四、实验步骤（一）取 2g 红霉素软膏，放入烧杯中，加 6ml 乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯调 pH 值为 7.2 8.0，抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用。（二）澄清滤

18、液放入搪瓷缸中用乙酸酸化 pH 值为 3.56.0，加乙酸丁酯分两次（每次加 1020ml）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置 30 min 使之分层，用 100ml 烧杯收集上层萃取液。（三）取上述下相液，加入一定体积的饱和食盐水，加入乙酸丁酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层后，将上层萃取液（BA 液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中（四）结晶和干燥：取量乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上述 BA 溶液中，带有沉淀时，搅拌后静置 30min 后过滤，得红霉素晶体，将湿晶体放入烧杯中，加异丙醇 30-50ml，搅拌成浆糊状，然后抽滤，将湿品平铺培养

19、皿中，真空干燥的干品。五、结果与分析 六思考 pH 的调节在提高红霉素萃取效率方面的重要性。常见的有机溶剂有哪些？红霉素萃取时为何选用饱和食盐水？（有两个作用一是防止乳化，二是降低有机化合物在水中的溶解度。）实验七 薄层色谱法鉴定果汁中的糖 一、实验目的 了解薄层色谱法的分离原理，掌握薄层色谱法鉴定果汁中的糖的操作技术。二、实验原理 对多组分的复杂混合物，无论是有机物或无机物，薄层色谱法是有效的分离手段之一。硅胶是常用的吸附剂，使用与酸性和中性物质的分离，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附能力不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分配系数的差异，从而达到分离。显色后得到色谱图，与在相同条

20、件下已知糖分的色谱图比较就能鉴定果汁中的糖分。未知物组分的鉴定是通过在同一块薄层板上分别点上标准样品和未知样品，通过比较斑点的比移值来定性鉴定。其中比移值 Rf 计算公式为：Rf=原点至斑点中心的距离/原点至展开剂前沿的距离 由于在相同条件下，物质的 Rf 值是一定的，因而比移值 Rf 可以进行物质的定性分析。分离之后，可以用适当的方法定量测定，如刮下有色斑点。将被测物浸取后用比色法测定其含量，或用薄层扫描仪扫描直接测出被测物的含量。三、实验器材 层析缸（筒）（10cm10cm）；微量注射器，若仅作定性鉴定，则可用玻璃毛细管来替代；薄层板：用 1010cm 玻璃板制作硅胶板、可剪截型薄层层析板

21、（10 cm 10 cm，0.2-0.25 mm铝基硅胶 G 板，天津市天河医疗有限公司）；吸附剂：硅胶 G（(青岛海洋化工有限公司生产，200260 目，化学纯）展开剂 1：正丁醇：丙酮：水4：3：1 显色剂 1：苯胺二苯胺磷酸（临用时配制：2g 二苯胺、2ml 苯胺、20ml85磷酸，与200ml 丙酮混溶）显色剂 2：把 10ml 硫酸缓慢倒入 90rnl 乙醇中混合冷却，制得 10的硫酸溶液 标准糖溶液：麦芽糖、果汁、蜂蜜、果糖、葡萄糖，分别溶于 10异丙醇中，使其浓度为 100mg/ml 新鲜果汁、蜂蜜、无水乙醇 四、实验步骤（1）制作薄层板 将玻璃板洗净至不挂水，晾干后置于干燥洁净

22、处备用。将 10 g 硅胶 G 加适量的水(约25 mL)，在研钵中用研杵向一个方向研磨制成均匀的有适当粘稠度的胶浆，立即倾倒于玻璃板中央，迅速振荡，使硅胶层厚度均匀。涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，并在105C 温度下活化 30 min 后，贮于干燥器中备用。硅胶层的厚度约为 0.1 mm，使用前用氯仿-甲醇(8:2)预洗，在 105C 温度下加热干燥 1 h。（2）点样 在 1010cm 的硅胶 G 薄板上离底边 2cm 处用铅笔划线，用微量注射器或玻璃毛细管点样（新鲜果汁及标准糖液），各斑点之间相距 2cm 且每个斑点的直径不超过 2mm，每个样品点 4 次，每次点样后用冷风吹干或

23、间隔一定时间使其自然干燥。在板上标出起始线和欲展开的前沿线，一般展开距离为 7cm 以上。（3）展开 把点样后的薄层板在红外灯烘干（若无红外灯，则在空气中晾干），将配好的展开剂倒入展开缸中，使展开剂在缸中的深度至少有 1cm 深，盖上盖子，混合均匀。等数分钟后让溶剂在展开缸中饱和后，再将已点好样的晾干的薄层板迅速的放入缸内，尽量不破坏缸内的气氛，盖上盖子。让薄层板的下部浸入展开剂溶液中约 0.5cm 以上（但注意不要让点样的斑点浸入到展开剂的溶液中，以免被溶液浸洗下来）；由于吸附剂的毛细管作用，展开剂和斑点不断向上迁移，直到展开剂前沿到事先预定好的刻度线后（一般完成一次展开过程需要 2530

24、分钟），可取出薄层板，。在红外灯下将展开剂蒸发（或在空气中晾干，此过程大约需 15 分钟）。（4）显色 在通风橱中，在薄层板上喷雾显色，随即在 100C 下烘烤 1020min，注意观察各种糖的颜色和计算 Rf，并以此鉴定果汁中的糖分。五、结果与讨论 1.计算出果汁中所含糖的 Rf；实验结果如下：从左往右样品分别为：麦芽糖、葡萄糖、果糖、果汁、蜂蜜。名称 麦芽糖 葡萄糖 果糖 果汁 蜂蜜 原点至斑点中心的距离 cm 5.0 5.3 5.1 4.3 5.5 原点至展开剂前沿的距离 cm 7.5 7.7 7.9 7.8 7.9 Rf 0.667 0.688 0.645 0.551 0.696 讨论

25、：从上表可以看出各种物质的Rf值不同，计算出的Rf值中，果汁的Rf值与果糖的Rf值最接近，故果汁中最有可能含有果糖。在点样时，样品点过大，可能会导致样品色谱变宽；果汁色谱颜色深，其原因可能是样品浓度过高;实验八 透析法脱盐 一、实验目的 学会透析的基本原理和操作。二、实验原理 蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。三、试剂及仪器 1.仪器 透析管或玻璃纸、烧杯、玻璃棒、电磁搅拌器、试管及试管架。2.试剂 蛋白质的氯化钠溶液（3个去黄的鸡蛋蛋清与700ml水及300ml饱和氯化钠溶液混合后，用

26、数层干纱布过滤）。1%硝酸银溶液、10%硝酸溶液、10%氢氧化钠溶液、1%硫酸铜溶液。四、实验步骤 1.用蛋白质溶液做双缩脲反应（加 10%氢氧化钠溶液约 1ml，振荡摇匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，振荡，观察出现的粉红颜色）。2.透析袋的预处理。将适当大小和长度的透析袋放在 50%乙醇中煮沸 1h（或浸泡一段时间），再用 10g/L 的碳酸钠溶液和 1mmol/L 的 EDTA 溶液洗涤，最后用蒸馏水洗涤 2-3 次，结扎袋的一端。3.向火棉胶制成的透析管中转入 10-15ml 蛋白质溶液并放在盛有蒸馏水的烧杯中，或用玻璃纸装入蛋白质溶液后扎成袋形，系于一横放在烧杯的玻璃棒上。4.约 1

27、h 后，从烧杯中取出 1-2ml 水，加 10%硝酸溶液数滴使呈酸性，再加入 1%硝酸银溶液 1-2 滴，检查氯离子的存在。5.从烧杯中另取水 1-2ml，做双缩脲反应，检查是否有蛋白质存在。6.不断更换烧杯中的蒸馏水，并用电磁搅拌器不断搅拌蒸馏水以加速透析过程。数小时后从烧杯的水中不能再检出氯离子时，停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质和氯离子的存在。（此时应观察到透析袋中球蛋白沉淀的出现，因为球蛋白不溶于纯水）。五、结果与分析 从氯离子和双缩脲反应检查结果，评价透析的效果。实验九 等电点法沉析法分离牛乳中酪蛋白 一、实验目的 1、学会牛乳中制备酪蛋白的原理和方法 2、等电点沉析法的基本操

28、作技术 二、实验原理 蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当 pI=pH 时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为 0，此时的该溶液的是 pH 值是该蛋白质的pI 值。某一蛋白质的 pI 大小是特定的,与该蛋白质结构有关，而与环境 pH 无关。在此时，蛋白质之间的静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在 pH 值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀（isoelectric precipitation）。三、试剂及仪器 1.材料 鲜牛奶 2.试剂 醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/l PH4.7 醋酸-醋酸

29、钠缓冲液 3、器具 烧杯 100ml、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、表面皿、抽滤瓶 四、实验步骤 1、将牛奶 30ml 及醋酸-醋酸钠缓冲液 30ml 分别水浴加热 40 摄氏度左右，用 8 层纱布过滤牛奶。2、量取加热后牛奶 20ml，在搅拌下加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液 20ml，调节 PH到 4.7.3、将混合液冷却到室温，3500r/min 离心 15min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。4、水洗沉淀 3 次，3500r/min 离心 10min.弃去上清液。5、沉淀中加入乙醇 20ml，搅拌片刻。将浑浊液转到布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤两次，最后用乙醚洗涤两次

30、，抽干。6、将沉淀摊开到表面皿上，风干的酪蛋白纯品。7、计算：含量=酪蛋白 g/100ml 牛奶 收率=测得含量/理论含量 理论含量为 3.5g/100ml 牛乳 五、结果 实验十 柱层析分离色素 一、【实验目的】1了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。2熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素 a、叶绿素 b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用 95%乙醇或无水乙醇提取。分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一

31、种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。本实验是把三氧化二铝填入

32、玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的 4 种色素（叶绿素 a、叶绿素 b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶 试剂：1 无水乙醇或 95%乙醇 2 石英砂 3 丙酮 4 石油醚（60-90）5.三氧化二铝 6饱和氯化钠溶液 7.水硫酸钠 8 洗脱液：丙酮：石油醚1：9 器材：层析柱（130cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试

33、管，铁架台 四、【实验操作】1 色素的提取：20 克菠菜，加少许石英砂，再加 20 毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入 30 毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入 40 毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20 毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥 5 分钟，备用.2样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体 5-8 毫升左右，以备加样使用。3层析拄的制备：15 克碱性三氧化二铝加入 30 毫升石油醚搅拌，浸泡 10min.。在层析拄内

34、加入一团棉花在底部，再加入石英砂 0.5cm 以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂 0.5 厘米高。4样品的分离层析：吸附层析分离色素 打开层析拄下部开关，向拄内加入 2 毫升浓缩液，至液体没入砂内，再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片 1，直至第一条色带洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片 2。五、【实验结果】六、结果分析：洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同

35、，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。七、【注意事项】1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。6、洗脱流速不宜过快，

36、避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟6080 滴为宜。7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而

37、不好。八、【实验小结】在该柱层析分离色素实验中，我了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。知识拓展：1、溶剂的选择：（1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。（2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。（3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。（4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。（5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶 解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，

38、然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又减少了溶液的体积。2、洗脱剂的选择：样品吸附在氧化铝柱上后，用合适的溶剂进行洗脱，这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的，可以改用其他溶剂，一般极性较强的溶剂影响样品和氧化铝之间的吸附，容易将样品洗脱下来，达不到分离的目的。因此常用一系列极性渐次增强的溶剂，既先使用极性最弱的溶剂，然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。己烷和石油醚环己烷四氯化碳三氯乙烯二硫化碳甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。实验十一 活性炭吸附分离色素实验 一、实验目的（1）了解吸附的基

39、本原理；（2）掌握活性炭、木炭的静态和动态吸附的基本操作技术。二、实验原理 活性炭具有较大的比表面，在水溶液中比一般固态物质吸附能力强很多，故可以吸附许多物质的分子及离子，本实验用活性炭、木炭静态和动态吸附溶液中的色素。三、实验仪器 离心机、大烧杯（500ml）、烧杯（250ml）、高精度 pH 试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。四、材料和试剂 1.材料 胡萝卜或红心萝卜 8kg、活性炭粉 8kg、脱脂棉 1 包。2.试剂（1）石蕊试剂 500ml、浓硝酸 500ml 高锰酸钾 400g；（2）组织捣碎机、烧杯、U 形管、漏斗、直通管、导管、漏斗架、胶塞、玻璃管、橡皮圈等。四、实验步骤 注意事

40、项：（1）、活性炭使用前一定要经过处理，增强他的吸附活性，实验前要将木炭或活性炭放在坩埚里烘烤，充分进行解吸。（2）、选用有色液体不要太浓，否则吸附不干净可能会出现色带，得不到无色清液（3）、榨取的胡萝卜汁在活性炭脱色前，应进行过滤前处理，避免汁液过黏影响吸附效果。（4）、所用锥形瓶在实验前应该是干燥的。六、结论 七、思考 1、木炭和活性炭那种吸附剂的吸附效果好？2、实验中第一步和第二步用同样的胡萝卜色素和活性炭，哪步吸附效果显著？实验十二 卵磷脂制备 实验十三银耳多糖的制备及鉴定和含量测定 实验十四 硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质（选做）一、实验目的（3）了解盐析法分离血清中主要蛋白质

41、的基本原理；（4）掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术。二、实验原理 盐析是最常见的分离蛋白质的方法，各种蛋白质所带的电荷不同、相对分子量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉淀下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。一般粗提物常用它进行粗分离。常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，其中最常用的是硫酸铵。用盐析法分离蛋白质简单安全，而且所得的蛋白质并不丧失活性，是分离纯化中最佳的一种方法。在实际操作中，可先将蛋白质调到等电点，使其溶解度达到最低，然后加入粉末固体硫酸铵或饱和硫酸铵溶液，并

42、达到一定浓度，这时蛋白质即从溶液中析出，经过滤或离心，透析除去盐，即可获得产品。硫酸铵的浓度一般以饱和度表示，在不同温度下达到一定饱和度所需浓度不同，详见附表。五、实验仪器 离心机、大烧杯（500ml）、烧杯（250ml）、高精度 pH 试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。四、材料和试剂 1.材料 新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）100ml。（为使血不凝固，可按血：10%柠檬酸钠=2：1 的比例配制）3.试剂（3）pH7.2 的饱和硫酸铵溶液（用氨水调节 pH）；（4）0.2mol/LpH7.2 的磷酸缓冲液（PBS），配制方法如下：A 液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（5.37g 磷酸氢二

43、钠加去离子水精确配制 100ml）；B 液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液（3.12g 磷酸二氢钠加去离子水精确配制 100ml）；取 A 液 72ml，B 液 28ml，边混合边用高精度 pH 试纸检测，调配成约 100ml 浓度为0.2mol/LpH7.2 的磷酸盐缓冲液备用。六、实验步骤 1.清蛋白与球蛋白分离（1）取 100ml 血浆或血清置于 500ml 烧杯中，加 PBS100ml 搅拌 10min。（2）在搅拌下慢慢滴加 200mlpH7.2 饱和硫酸铵溶液。（3）加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌 20-30min 以充分沉淀球蛋白。（4）离心（3500r/min）20min，弃去

44、上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。2.各种球蛋白的分离（1）用 100mlPBS 溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至 250ml 烧杯中搅拌 15min。（2）在搅拌下，慢慢滴加 25ml 饱和硫酸铵溶液，饱和度达 20%。（3）离心（3500r/min）20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液。（4）上清液在搅拌下，慢慢滴加 18-25ml 饱和硫酸铵溶液，饱和度达 30%-33%。（5）离心（3500r/min）20min 得上清液和沉淀（主要含-球蛋白和少量-球蛋白）。（6）取（5）中的沉淀溶于 PBS 中使体积达 100ml 并转移至 250ml 烧杯中搅拌 15min

45、。（7）在搅拌下，慢慢滴加 43-50ml 饱和硫酸铵溶液，饱和度达 30%-33%。（8）离心（3500r/min）20min 得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）。（9）取（5）中的上清液在搅拌下，慢慢滴加 35-40ml 饱和硫酸铵溶液，饱和度约达 45%。（10）离心（3500r/min）20min 得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）。七、结果与分析（1）观察每一次沉淀后的清液和沉淀，记录上清液和沉淀的状态和质量。（2）如果要对不同组分所包含的主要成分进行验证可采取哪些方法？八、注意事项（1）缓冲液的配制应准确（2）滴加饱和硫酸铵溶液的速度要慢一些，搅拌的速度应适中。（3）加完硫酸铵溶液后要静置一段时间，至少 20-30min，使沉淀完全。为证明分离的效果，可和实验“凝胶层析法测定蛋白质分子质量”配合进行。