饲料粗蛋白检测方法29578.pdf

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1、饲料粗蛋白的检测方法（凯氏半微量定氮法）1 原理 凯氏法测定试样含氮量，即在催化剂存在下，用浓硫酸破坏有机物，使含氮 物转化成硫酸铵，加入强碱（NaOH 并蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐 酸溶液滴定测出含氮量，将结果乘以换算系数 6.25，计算出粗蛋白质含量。2 仪器设备 2.1 实验室用样品粉碎机或研钵 2.2 分样筛：孔径 0.45mm（40 目）2.3 分析天平：感量 0.0001g 2.4 消煮炉或电炉 2.5 滴定管：酸式 25mL 2.6 凯氏烧瓶：100mL 2.7 凯氏蒸馏装置：半微量水蒸汽蒸馏式 2.8 锥形瓶：150mL 2.9 容量瓶：100mL 3 试剂 3.1

2、硫酸：分析纯 3.2 硫酸铜：分析纯 3.3 硫酸鉀：分析纯 3.4 硒粉：分析纯 3.5 氢氧化钠：分析纯 40g 溶于 100mL 蒸馏水配成 40%水溶液。3.6 硼酸：分析纯 2g 溶于 100mL 蒸馏水配成 2%水溶液。3.7 混合指示剂：甲基红分析纯 0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿分析纯 0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。3.8 0.02N 盐酸标准溶液：1.67mL 盐酸分析纯溶于 1000mL 蒸馏水中。3.8.1 0.02N 盐酸标准溶液的标定（碳酸钠法）精确称取 0.04g 于 270 300 C 灼烧至恒重的基准级无水碳酸钠，准确至 0.0001g

3、，无损失地转入 100 mL 三角瓶中，加入无 CQ 蒸馏水（新做蒸馏水或蒸 馏水煮沸数分钟放凉后使用）50mL 溶解，并加入混合指示剂 10 滴，用盐酸标准 溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸 2 分钟，冷却后继续滴定至溶液呈暗红 色，同时做空白试验。3.8.2 盐酸标准溶液当量浓度的计算 G N=-（V 1-V2）0.05299 式中：G无水碳酸钠的重量，g;V i盐酸标准溶液消耗的体积，mL V 2空白试验所消耗盐酸标准溶液的体积，mL 0.05299 每毫克当量碳酸钠的克数；注：标定各浓度间的相对偏差不大于 0.2%。3.9 蔗糖：分析纯 3.10 硫酸铵：分析纯，干燥。4 试样的选

4、取与制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至 200g，粉碎后全部通过 40 目筛，装 于密封容器中，防止试样成分变化。5 测定方法及步骤 5.1 试样的消煮 称取 0.5 1g 试样（粗蛋白含量在 25%以下称取 1g,粗蛋白含量在 25%以上 称取 0.5g），准确至 0.0002g，放入凯氏烧瓶中，加入硫酸铜 0.4g，无水硫酸钾 6g,硒粉 0.004g，与试样混合，再加浓硫酸 12.5mL，在消煮炉上小心加热，待 样品焦化，泡沫消失，加强火力，至溶液澄清后，再加热至少 1h。5.2 氨的蒸馏（半微量水蒸汽蒸馏法）将上述消煮液冷却，无损失地转入 100 mL 容量瓶中，冷却后定容为试样

5、分解 液，取 20 mL 2%硼酸溶液，加混合指示剂 2 滴，使半微量蒸馏装置的末端浸入 此溶液，准确移取试样分解液 10 mL 注入反应室中，塞好入口玻璃塞，再加入 10mL 40%NaoH 溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室（加碱时流速不可过快，否则会引起硼酸吸收液倒流），塞好玻璃塞，并在入口处加水密封好，防止漏气，蒸馏，自吸收液变为蓝色开始计时，4 分钟后，使冷凝管末端离开吸收液面，再 蒸馏 1 分钟，用蒸馏水洗净冷凝管末端，洗液均流入吸收液 5.3 滴定 吸收氨后的吸收液立即用 0.02mol/L 的标准溶液滴定，溶液由蓝色变成灰红 色为终点，记录所耗标准溶液的体积。5.4 空白测定

6、称取蔗糖 0.5g 代替试样，重复上述操做，以校正药品不纯所发生的误差,消耗 0.02mol/LHCL 应不超过 0.3mL。6 测定结果的计算与分析 6.1 计算公式如下：(V-Vo)X(N X 0.014 X 6.25)X 100 粗蛋白(%=-W X V/V 式中：V-滴定试样时所需酸标准溶液体积，mL V 0-滴定空白时所需酸标准溶液体积，mL N 盐酸标准溶液当量浓度；W 试样重量，g;V 试样分解液总体积，mL V-试样分解液蒸馏用体积，mL 0.0140 氮的毫克当量数；6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。6.2 重复性 每个试样取两个平行样，以其算数平均值为结果；粗蛋白含量在

7、25%以上，允许相对偏差为 1%粗蛋白含量在 10-25%之间，允许 相对偏差为 2%粗蛋白含量在 10%以下，允许相对偏差为 3%7 测定步骤的检验 精确称取 0.2g 硫酸铵，代替试样，按上述步骤操作，按上述公式计算(不 乘系数 6.25)，测得硫酸铵含氮量为 21.19 0.2%，否则应检查加碱，蒸馏和滴 定各步骤是否正确。8 注意事项 8.1 试样消煮时，先低温加热，避免泡沫溢出，待泡沫消失后，再逐渐增加温度，使之微沸，避免剧烈沸腾，否则会使氮分子损失。8.2 加碱必须过量，碱除了与铵盐和剩余的硫酸作用，还与硫酸铜作用生成蓝色 氢氧化铜，然后分解为黑色氧化铜。8.3 消化过程中，若硫酸损失过多，可酌量补加硫酸，勿使瓶内干涸。