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1、实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶(PPO)活性测定及酶学性质 一、实验目的 1 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。2 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。二、实验原理 马铃薯不耐储藏,在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变,使外观品质和营养价值大为降低,制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫
2、的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO 催化酚与 O2 氧化形成醌,使组织形成褐变以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此,检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在一定的温度、pH 条件下,有氧存在时,能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质,单位时间内有色物质在 410nm 处的吸光度与酶活性强弱成正相关,在分光光度计 410nm 处使反应体系的 OD 值产生变化,通过 OD 值的变化确定 PPO 的酶活大小。多酚氧化酶 邻苯二酚(儿茶酚)12O2邻醌H2O 三、试验材料、试剂及试验用品 1材料:马
3、铃薯块茎。2仪器:分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;试管;移液管;容量瓶 3试剂:L 磷酸缓冲液(pH=);L 邻苯二酚;L 磷酸氢二钠;L 磷酸二氢钠;10mmol/L 柠檬酸;10mmol/L 抗坏血酸;10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠(EDTA);10mmol/L 亚硫酸钠 四、实验方法:1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品,加入预冷的磷酸缓冲液()3ml,研磨匀浆,转移到离心管中,再用 7mL 磷酸缓冲液冲洗研钵,合并提取液,在下离心(8000r/min)5min,取上清液为多酚氧化酶提取液,并量取粗酶液体积。2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将l 邻苯二酚加入 2l 磷酸
4、缓冲液()中,加入l 酶提取液,立即于波长 410nm 下测定吸光值,2min 后再计吸光值,以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为:ml 缓冲液和 mL 邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为 1 个多酚氧化酶活性单位。表 1 多酚氧化酶活性测定 磷酸缓冲液(mL)邻苯二酚(mL)粗酶液(mL)OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力(U)空白组 0 试验组 3.多酚氧化酶酶活的计算公式:以每克样每分钟内 A410 增加为 1 个酶活力单位 U。A410酶提取液总量(ml)酶活力(g min)反应时间(min)样品鲜重(g)测定时酶液用量(ml)4 酶学特性 PH 对多酚氧化酶
5、活性的影响 室温下在试管中加入已配好的不同 pH 值的缓冲溶液,邻苯二酚,多酚氧化酶粗酶液 mL,混匀后迅速测定吸光度,转换为多酚氧化酶的活性。以缓冲液 pH 值为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活pH 曲线,以确定最适 pH 值。表 2 pH 对多酚氧化酶活性的影响 组号 不同 pH 的磷酸缓冲液(mL)邻苯二酚(mL)粗酶液(mL)OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力(U)1 pH=4,2 pH=5,3 pH=6,4 pH=7,5 pH=8,温度对多酚氧化酶活性的影响 试管中加入 pH 的磷酸盐缓冲溶液,以邻苯二酚溶液为底物,在不同温度(常温、40、60的温度条件)
6、下保温 5min 后,加入多酚氧化酶粗酶液,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以温度为横坐标,多酚氧化酶活性为纵坐标,作出酶活温度曲线,以确定最适温度。表 3 温度对多酚氧化酶活性的影响 温度 磷酸缓冲液(mL)邻 苯 二酚(mL)粗酶液(mL)OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力(U)室温 40 60 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 将抑制剂抗坏血酸(VC)、柠檬酸、亚硫酸钠、EDTA 分别用的磷酸盐缓冲溶液配制成10mmol/L 的溶液,在室温下分别取上述抑制剂,以邻苯二酚溶液为底物,加入多酚氧化酶粗酶液,混匀后在室温下测定多酚氧化酶的活性。以抑制类型为横坐标,多酚氧化酶
7、活性为纵坐标,绘制抑制剂对酶活影响的图形,分析抑制剂对酶活性影响。表 4 抑制剂对多酚氧化酶活性的影响 抑制剂 磷酸缓冲液(mL)邻 苯 二酚(mL)粗酶液(mL)OD410 2min 后OD410 OD410 酶活力(U)抗坏血酸 柠檬酸 亚硫酸钠 EDTA 五、注意事项 1、反应混合液必须现配现用,否则会因邻苯二酚自动氧化而失效;2、在试验中加入一种酚结合剂-聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),它能与酚类化合物强烈地发生缔合作用,从而消去酶反应体系中的底物,使 PPO 活性的测定更接近其真值。3、使用分光光度计时要求动作快速、熟练。4、加样时,先加缓冲溶液,再加底物邻苯二酚,摇匀,在测量之前最后加酶提取液。六、思考题 1.本试验中使用到磷酸缓冲液,请问磷酸缓冲液在本试验中的作用 2.试分析不同温度、pH 对马铃薯多酚氧化酶的影响 3.谈谈你对多酚氧化酶活性性质的认识。参考文献:曹建康,姜微波,赵玉梅编着.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社,.毛丽梅,邓红,马安德,卢晓翠。食品安全综合实习指导.科学出版社,.104-105 李彩霞 张芬琴 张喜峰 赵金梅 白生文
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