氯化钙法感受态制备29120.pdf

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1、氯化钙法(Calcium Chloride)本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得 5 x 106 到 2x 107转化克隆/微克超螺旋质粒 DNA 材料(MATERIALS)缓冲液和溶液(Buffers and Solutions)(冰冷的)CaCl2?2H2O(1 M)冰冷的 MgCl2-CaCl2 s 溶液(solution,ice cold)培养基(Media)用于初始培养物培养的 LB 肉汤(L-broth for initial growth of culture)LB agar plates containing appropriate antibioti

2、c 核酸(Nucleic Acids)质粒 DNA(Plasmid DNA)或经过重组的质粒(recombinant plasmid)方法 1从 37 C 过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为 2 到 3 毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有 5 毫升 LB 肉汤的 30 毫升灭菌试管中，于 37 C 下振荡培养过夜。2.转移 0.2 毫升过夜培养物于一只装有 15 或 20 毫升 LB 的 50 毫升灭菌三角瓶中于 37OC 下振荡培养 2 到 2.5 小时(此时细菌处于对数生长期)3.室温下，4000 rpm 离心 5 分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。

3、5.加入 10 毫升冰冷的 MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。6.4C 下，4000 rpm 离心 10 分钟收集细胞。7.弃 MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。8.加入 0.8 毫升（每 25 毫升初始培养物加入 1 毫升）冰冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。9.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤 10 到 16 直接进行转化操作，也可以 分装,加入甘油后于-70C 冰冻保藏。10.向事先灭菌，并经冷处理的 1.5ml 聚丙烯管中转移 100 微升感受态细胞悬浮 液。向每个转化管中加入 DNA（般含量是 10 微升或更低的体积中所含量

4、应不 超过 50 纳克）。细心混匀管中成份。于冰浴放置 30 到 40 分钟。11.把转化管转移至放于 42 C 循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时 90 秒。（此时不能摇动转化管）12.把试管迅速转移至冰浴 2 到 3 分钟。13.向每只试管中加入 500 微升 LB 肉汤。37C 放置 45 到 90 分钟，以使细菌复 原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。14.转移适量体积（如果使用 90 毫米平板，一半涂布量不应超过 100 微升）的 经转化处理的感受态细胞涂布于含有 相应抗生素的 LB-琼脂平板上。15.室温放置平板直到其上液体被吸收。16.于 37C 倒置平板培养。转化克隆应该

5、于 12-16 小时区间出现。感受态原理：在自然条件下,很多质粒都可通过 细菌接合作用 转移到新的宿主内,但在人工构建 的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一 个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感 受态以摄取外源 DNA。转化（Transformation）是将外源 DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一 种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶 和甲基化酶的突变体（R-,M-它可以容忍外源 D

6、NA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜 的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新 的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但 CaCl2 法简便易

7、行,且其转化效率完 全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15的无 菌甘油于-70 C保存(半年),因此 CaCI2 法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑 以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4C 的培养菌，最好从-70 C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对 数生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。DHa 菌株的 OD600 为 0.5 时,细胞密度在 5X107个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足 均会影响转化效率。2.

8、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转 化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过 大时,转化效率就会降低。1ng 的 cccDNA 即可使 50 卩 l 的感受态细胞达到饱和。一般情况 下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。3试剂的质量：所用的试剂，如 CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或 ARJ,并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如 离心管,tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂

9、都要灭菌,且注意防止被其它试 剂、DNA 酶或杂DNA 所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞，并用 CaCl2 处理，使其处于感受态，然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过 Amp 抗 性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒 提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以 E.coli DH5a 菌株为受

10、体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过 Amp 抗 性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS，则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒 提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节 材料、设备及试剂 一.材料 E.coli DH5 菌株：R-,M-,Amp_pBS 质粒 DNA:购买或实验室自制，eppendof 管。二.设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水

11、浴锅,制冰 机,分光光度计,微量移液枪。三.试剂 1.LB 固体和液体培养基：配方见第一章。2.Amp 母液：配方见第一章。3含 Amp 的 LB 固体培养基：将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60C左右，加 入 Amp 储存液,使终浓度为 50ug/ml,摇匀后铺板。4麦康凯培养基（Maconkey Agar）:取 52g 麦康凯琼脂，加蒸馏水 1000ml,微火煮沸至完全 溶解，高压灭菌，待冷至 60C左右加入 Amp 储存液使终浓度为 50ug/ml,然后摇匀后涂板。5.0.05mol/L CaCI2 溶液：称取 0.28g CaCI2（无水,分析纯）,溶于 50ml 重蒸水中

12、，定容至 100ml,高压灭菌。6含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl2:称取 0.28g CaCl2（无水,分析纯）,溶于 50ml 重蒸水中，加入15ml 甘油，定容至 100ml,高压灭菌。第三节 操作步骤 一、受体菌的培养 从 LB 平板上挑取新活化的 E.coli DH5 a单菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37 C 下振荡培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB 液体培养基中，37 C振荡培养 2-3 小时至 OD600=0.5 左右。二、感受态细胞的制备（CaCl2 法）1、将培养液转入离心

13、管中，冰上放置 10 分钟,然后于 4C下 3000g 离心 10 分钟。2、弃去上清,用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟后,4 C下 3000g 离心 10 分钟。3、弃去上清，加入 4ml 预冷含 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰 上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成 200 卩的小份，贮存于-70C可保存半年。转化 1、从-70C冰箱中取 2001 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。2、加入 pBS 质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng,体积不

14、超过 10 卩 I）轻轻摇匀，冰上放置 30 分钟后。3、42C水浴中热击 90 秒或 37C水浴 5 分钟，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。4、向管中加入 1ml LB 液体培养基（不含 Amp）,混匀后 37C振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。5、将上述菌液摇匀后取 100 卩 l 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待 菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37C培养 16-24 小时。同时做两个对照:对照组 1:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上

15、应没有菌落出现。对照组 2:以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5 卩 l 菌液涂布于不含 抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转 化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数 X稀释倍数 刈转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率（转化子数/每 mg 质粒 DNA）=转化子总数/质粒 DNA 加入量（mg）感受态细胞总数=对照组2菌落数 X 稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数 注意 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们 的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单 菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩（如离心）,才能较准确的计算转化率。