2022年叶利民的微生物实验教案.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载试验 1 培育基的配制一、试验目的和内容 目的：学习和把握配制培育基的一般方法和步骤；内容： 1牛肉膏蛋白陈培育基的配制；2高氏 1 号培育基的配制；3马丁氏培育基的配制；二、试验材料和用具牛肉膏、 蛋白胨、 琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、 孟加拉红、 链霉素、 1mol/L NaOH 、lmol/L HCl 、KNO 3、NaCl 、K2HPO43H2O、MgSO 47H 2O、FeSO47H 2O；试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等；三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培育

2、基的配制pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号牛肉膏蛋白胨培育基是一种应用最广泛和最一般的细菌基础培育基；其配方如下：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl5g ,琼脂 15 20g,水 1000mL ,PH7.47.6 1称药品 按实际用量运算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中；牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分别,立刻取出纸片；蛋白胨极易吸潮,故称量时要快速；2加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌, 待药品完全溶解后再补充水分至所需量；如配制固体培育基,就将称好的琼脂放入己溶

3、解的药品中,再加热融解,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最终补足所失的水分；3 调 pH 检测培育基的 pH ,如 pH 偏酸,可滴加 lmol/L NaOH ,边加边搅拌,并随时用 pH 试纸检测,直至达到所需 pH 范畴； 如偏碱, 就用 lmol/L HCl 进行调剂； pH 的调剂通常放在加琼脂之前；应留意pH 值不要调过头,以免回调而影响培育基内各离子的浓度；4过滤液体培育基可用滤纸过滤,固体培育基可用4 层纱布趁热过滤,以利培育的观看；但是供一般使用的培育基,这步可省略；5分装按试验要求, 可将配制的培育基分装入试管或三角瓶内；分装时可用漏斗以免使培育基沾在管口或瓶口上而

4、造成污染；分装量：固体培育基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面；分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培育基以试管高度的 1/3 为宜,灭菌后垂直待凝；6加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用一般棉花 非脱脂棉 制作的棉塞；棉塞的外形、大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁, 不留缝隙, 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用；要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落；有些微生物需要更好的通气,就可用 8 层纱布制成通气塞；有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞；7包扎加塞后, 将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞；如培育基分装于试管中,就应以5 支或 7 支在

5、一起, 再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好；然后用记号笔注明、培育基名称、组别、日期；8灭菌将上述培育基于121.3湿热灭菌20min；如因特殊情形不能准时灭菌,就应故交冰箱内暂存；名师归纳总结 9摆斜面灭菌后, 如制斜面, 就需趁热将试管口端搁在一根长木条上,并调整斜度,第 1 页,共 19 页便斜面的长度不超过试管总长的1/2；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 10无菌检查学习必备欢迎下载2448h,无菌生长即可使用,或将灭菌的培育基放入37温箱中培育贮存于冰箱或清洁的橱内,备用；（二）高氏 l 号培育基的配制高氏 1 号培育基是用于分别和培育放线菌

6、的合成培育基；其配方如下：可溶性淀粉 20g,KNO 3 1g,NaCl 0.5g,K 2HPO4 3H 2O 0.5g,MgSO 47H 2O 0.5g,FeSO47H 2O 0.01g,琼脂 1520g,水 1000mL ,pH7.47.6；l称量和溶解 先运算后称量,按用量先称取可溶性淀粉,放入小烧杯中,并用少量冷水将其调成糊状,再加至少于所需水量的水,连续加热,边加热边搅拌,至其完全溶解；再加入其他成分依次溶解；对微量成分FeSO47H 2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入,方法是先在 1000mL 中加入 1g 的 FeSO4 7H 2O,配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液,再在

7、 1000mL培育基中加入以上贮备液 1mL 即可；待全部药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积；如要配制固体培育基,其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培育基配制；2pH 调剂、分装、包扎及无菌检查（三）马丁氏培育基的配制同牛肉膏蛋白胨培育基配制；马丁氏培育基是用于分别真菌的挑选培育基；其配方如下：K2HPO4 1g,MgSO 4自然 pH；7H2O 0.5g,蛋白胨 5g,葡萄糖 l0g,琼脂 1520g,水 1000mL ,1称量和溶解 先运算后称量,按用量称取各成分,并将其溶解在少于所需的水中；待各成分完全溶解后,补充水分到所需体积；再将孟加拉红配成 1%的水溶液,在 1000mL培育液中加入

8、以上孟加拉红溶液 培育基配制；3.3mL ,混匀后,加入琼脂加热融解,方法同牛肉膏蛋白胨2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培育基配制；3链霉素的加入 链霉素受热简洁分解, 所以临用时, 将培育基融解后待温度降至 45左右时才能加入；可先将链霉素配成 1%的溶液 配好的链霉素溶液储存于-20,在 100mL培育基中加 1%链霉素 0.3mL ,使每毫升培育基中合链霉素 30 g；四、留意事项称药品用的牛角匙不要混用,称完药品应准时盖紧瓶盖；调 调；不同培育基各有配制特点,要留意具体操作；五、试验报告pH 时要当心操作,防止回记录本试验配制培育基的名称、数量,并图解说明其配制过程,指明要点

9、；六、问题和摸索l配制培育基有哪几个步骤 .在操作过程中应留意些什么问题 .为什么 . 2培育基配制完成后,为什么必需立刻灭菌 .如不能准时灭菌应如何处理 .已灭菌的培养基如何进行无菌检查 . 3试设计试验对饮料进行无菌检查；试验 2 高压蒸汽灭菌一 目的要求1明白高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范畴；2学习高压蒸汽灭菌的操作方法；二 基本原理名师归纳总结 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热, 使灭菌锅隔第 2 页,共 19 页套间的水沸腾而产生蒸汽；待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气- - - - - - -精选学习资料 - - - - - -

10、 - - - 学习必备 欢迎下载阀,连续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌锅内的压力,从而使沸点增高,得到高于 100的温度；导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的；在同一温度下, 湿热的杀菌效力比干热大；其缘由有三： 一是湿热中细菌菌体吸取水分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低（表 21）,二是湿热的穿透力比干热大（表 22）,三是湿热的蒸汽有潜热存在；1g 水在 100时,由气态变为液态时可放出 2.26kJ千焦 的热量；这种潜热,能快速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力；表 21 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量 /% 30 分钟内凝固所需温度

11、 /50 56 25 7480 18 8090 6 145 0 160170 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度；灭菌锅内留有不同重量空气时,压力与温度的关系见（表 2 3）表 2-2 干热温热穿透力及灭菌成效比较温度 /时间 /h 20 层透过布层的温度/100 层灭菌10 层干热4 86 72 70.5 不完全130-140 湿热 105.3 3 101 101 101 完全表 23 灭菌锅留有不同重量空气时,压力与温度的关系压力数 全部空气 2/

12、3 空气 1/2 空气 1/3 空气 空气全不Mpa Kg/cm 2Ib/in 2 排出时的 排出时的 排出时的 排出时的 排出时的温度 /温度 /温度 /温度 /温度 /0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 72 0.07 0.70 10 115.6 109 105 100 90 0.10 10.5 15 121.3 115 112 109 100 0.14 1.40 20 126.2 121 118 115 109 0.17 1.75 25 130.0 126 124 121 115 0.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121 现在法定压力单位己

13、不用磅和 kg/cm 2 表示,而是用 Pa 或 bar 表示,其换算关系为：1kg/cm 2=98066.5Pa；1Ib/in 2=6894.76Pa. 一般培育基用 0.1Mpa （相当于 15 Ib/in 2 或 1.05kg/cm 2）,121.5,15 30min 可达到彻底灭菌的目的；灭菌的温度及维护的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情形而有所转变；例如含糖培育基用 0.06Mpa（8Ib/in 2 或 0.59kg/cm 2）112.6 灭菌,然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液；又如盛于试管内的培育基以0.1Mpa,121.5 灭菌 20min 即可,而盛于大名师归纳总结 瓶内的

14、培育基最好以0.1Mpa,122灭菌 30min；22,B）二第 3 页,共 19 页试验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式（图2-2 ,A）和手提式（图种,其结构和工作原理相同,本试验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例,介绍其使用方法,有关自控高压蒸汽灭菌锅（autoclave ）的使用可参照厂家说明书；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载三 器材牛肉膏蛋白胨培育基,培育皿 四 操作步骤6 套一包 ,手提式高压蒸汽灭菌锅等；1第一将内层锅取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜；切勿遗忘加水,同时水量不行过少,以防灭菌锅烧干而

15、引起炸裂事故；2放回内层锅,并装入待灭菌物品；留意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭 菌成效；三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞；3加盖,并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内；再以两两对称的方式同时旋紧 相对的两个螺栓,使螺栓松紧一样,勿使漏气；4用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气；待冷空气 当锅内压力升到所需 完全排尽后, 关上排气阀, 让锅内的温度随蒸汽压力增加到逐步上升；压力时,掌握热源,维护压力至所需时间；本试验用0.1Mpa ,121.5, 20min 灭菌；灭菌的主要因素是温度而不是压力；因此锅内冷空气必需完全排尽

16、后,才能关上排气阀,维护所需压力；5灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的 压力降至“0” 时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品；压力肯定要降到“0” 时,才能打开排气阀,开盖取物；否就就会因锅内压力突然下降,使容器内的培育基由于内外压力不平稳而冲出烧瓶口或试管口,污染,甚至灼伤操作者；造成棉塞沾染培育基而发生6将取出的灭菌培育基,需摆斜面的就摆成斜面,然后放入37温箱培育24h,经检查如无杂菌生长,即可待用；五 试验报告l结果 检查培育基灭菌是否完全；2摸索题（1）高压蒸汽灭菌开头之前,为什么要将锅内冷空气排尽 .灭菌完毕后, 为什么待压力降低“

17、0” 时才能打开排气阀,开盖取物？（2）在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切担心全的因素 . （3）灭菌在微生物试验操作中有何重要意义 . （4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强 .为什么 . 试验 3 土壤的稀释分别、纯化微生物及无菌操作技术一、试验目的和内容 目的：学习从土壤中分别微生物的方法,学习无菌操作技术；内容：l用稀释法分别细菌、放线菌和霉菌；2用平板划线方法分别微生物；3学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术；二、试验材料和用具 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus和一般变形菌 Proteus vulgaris 斜面菌种；1 号、土豆蔗糖固体

18、培育基各 1 瓶, 49.5mL 无菌水 带玻璃珠 1 已灭菌的牛肉膏、高氏 瓶, 4.5mL 无菌水 6 管, 80%乳酸, 10%酚液, 95%乙醇；名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 19 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载无菌培育皿 12 套, 1mL 无菌移液管 10 支,土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头 用 75%乙醇浸泡 、玻璃刮；三、操作步骤一土壤稀释分别1取土壤取表层以下510cm 处的土样,放入无菌的袋中备用,或放在4冰箱中暂存；2制备稀释液 要无菌操作 1制备土壤悬液：称土样 0.5g,快速倒入

19、带玻璃珠的 49.5mL 无菌水瓶中 玻璃珠用量以布满瓶底力最好 ,振荡 510min,使土样充分打散,即成为 10-2 的土壤悬液；2稀释：用无菌移液管吸 10-2 的土壤悬液 0.5mL ,放入 4.5mL 无菌水中即为 10-3稀释液,如此重复,可依次制成 10-310-8的稀释液 图 3-1；留意：操作时管尖不能接触液面,每一个稀释度换用一支移液管,每次吸入土液后,要将移液管插入液面,吹吸 3 次,每次吸上的液面要高于前一次,以削减稀释中的误差；3. 混菌法测定菌落数的方法 1细菌：取 10-7、10-6 两管稀释液各1mL,分别接人相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿；然后取冷却至

20、 50的牛肉膏琼脂培育基,分别倒入以上培育皿中 装量以铺满皿底高 1.52mm 为宜 ,快速轻轻摇动平皿,使菌液与培育基充分混匀,但不沾湿皿的边缘,待琼脂凝固即成细菌平板；倒平板时要留意无菌操作,（2）放线菌：取 10-5、10-4两管稀释液,在每管中加入 10%酚液 56 滴,摇匀,静置片刻,然后分别从两管中吸出 1mL 加入相应标号的平皿中,选用高氏 1 号培育基,用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放线菌平板；（3）霉菌：取 10-2、10-3 两管稀释各 1mL,分别接入相应标号的平皿中,每个稀释度接两个平皿；在融解的土豆蔗糖培育基中,每 100mL 加入灭菌的乳酸 1mL ,轻轻摇

21、匀,然后用与细菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板；4培育 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置,即皿盖朝下放置,于 2830中恒温培育,细菌培育 12d,放线菌培育 57d,霉菌培育 35d；观看生长的菌落,用于进一步纯化分别或直接转接斜面；（二）平板制作及划线分别方法；1倒平板 按无菌操作要求,在火焰旁操作（图 32）,做法如 3（1）；2划线分别 使用接种环,从待纯化的菌落或待分别的斜面菌种只沾取少量菌样,在相应培育基平板中划线分别,划线的方法多样,目的是获得单个菌落,3培育方法同“ 土壤稀释分别”；四、留意事项1一般土壤中, 细菌最多, 放线菌及霉菌次之,而酵母菌主要见于果园及菜

22、园土壤中,故从土壤中分别细菌时,要取较高的稀释度,否就菌落连成一片不能计数；2在土壤稀释分别操作中,每稀释10 倍,最好更换一次移液管,使计数精确；3放线菌的培育时间较长,故制平板的培育基用量可适当增多；五、试验报告1记录土壤稀释分别结果,并运算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量；运算方法：挑选长出菌落数30300 之间的培育皿进行计数,按以下公式：总菌数 /g=同一稀释度几次重复的菌落平均数 稀释倍数 2分别记录平板划线、斜面接种的结果,并自我评判；3比较两种细菌穿刺接种的结果,并进行分析；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 19 页精选学习资料 - - - - -

23、- - - - 学习必备 欢迎下载七、问题和摸索1在测定土壤微生物含量中,除混菌法外仍可用什么方法 . 2试设计试验,从土壤中分别出酵母菌,并进行计数；名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 19 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载试验 4 显微镜油浸系物镜的使用一、试验目的和内容 目的：复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术,明白油浸系物镜的基本原理,把握油 浸系物镜的使用方法；内容： 1学习油浸系物镜的使用方法；2用油镜观看枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片；二、试验材料和用具枯草芽孢杆菌 Bacillus subitilis 、金黄色葡萄

24、球菌 香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸；三、操作步骤一观看前的预备Staphylococcus aureus的染色装片；1将显微镜置于平稳的试验台上,镜座距试验台边沿约为 4cm；坐正,练习用左眼观 察；2调剂光源：将低倍物镜转到工作位置,把光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距 约 1mm 左右；转动反光镜采集光源,光线较强的自然光源宜用平面镜,光线较弱的自然光源或人工光源宜用凹面镜,对光至视野内匀称光明为止；观看染色装片时,光线宜强； 观看末染色装片时,光线不宜太强；二低倍镜观看染色装片 第一上升镜简,将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上,用标本夹夹住,将观看位置 移至物镜正下方, 物镜降至距装

25、片 0.5cm 处,适当缩小光圈然后两眼从目镜观看,转动粗调 节器使物镜逐步上升 或使镜台下降 至发觉物像时,改用细调剂器调剂到物像清晰为止；移 动装片,把合适的观看部位移至视野中心；三高倍镜观看 眼睛离开目镜从侧面观看,旋转转换器,将高倍镜转至正下方,留意防止镜头与玻片 相懂； 再由目镜观看,认真调剂光圈,使光线的光明度相宜；用细调剂器校正焦距使物镜清 晰为止；将最相宜观看部位移至视野中心,绘图；不要移动装片位置,预备用油镜观看；四油镜观看1提起镜筒约2cm,将油镜转至正下方；在玻片标本的镜检部位镜头的正下方滴一滴香柏油；2从侧面凝视,当心渐渐降下镜筒,使油镜浸在油中至油圈不扩大为止,镜头几

26、乎与 装片接触,但不行压及装片,以免压碎玻片,损坏镜头；3将光线调亮,左眼从目镜观看,用粗调剂器将镜筒渐渐上升 切忌反方向旋转 ,当 如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到 视野中有物像显现时,再用细调剂器校正焦距；物像,必需再从侧面观看,将油镜降下,重复操作直至物像看清为止；认真观看并绘图；4再次观看 提起镜筒,换上金黄色葡萄球菌染色装片,依次用低倍镜、高倍镜和油 镜观看,绘图；重复观看时可比第一次少加香柏油；五镜检完毕后的工作 1移开物镜镜头；2取出装片；3清洁油镜,油镜使用完毕后,须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,再用擦镜纸沾少许 二甲苯擦掉残留的香柏油,最终再用洁净的擦镜纸擦干残留的二甲苯

27、；名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 19 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载4擦净显微镜,将各部分仍原；将接物镜呈“ 八” 字形降下,不行使其正对聚光器,同时降下聚光器,转动反光镜使其镜面垂直于镜座；最终套上镜罩,对号放入镜箱中,置阴 凉干燥处存放；四、留意事项 1使用油镜必需按先用低倍镜和高倍镜观看,再用油镜观看 2下降镜头时,肯定要从侧面凝视,切忌用眼睛对着目镜,边观看边下降镜头的错误 操作,以免压碎玻片而损坏镜头；3使用二甲苯擦镜头时,留意二甲苯不能过多,以防溶解固定透镜的树脂；4留意保持显微镜的洁净,对金属部分要用软布擦拭,擦镜

28、头必需用擦镜纸,切勿用 手或用一般布、纸等,以免损坏镜头；五、试验报告 分别绘出在高倍镜和油镜下观看到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的外形,注明物 镜放大倍数和总放大率；六、问题和摸索 1用油镜便于观看细菌的依据是什么？2使用油镜应特殊留意哪些问题？3当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时,对比明度有何要求？应如何调剂？油镜的基本原理（一）油镜头的辨认 油镜头上常刻有 OIoil immersion 或 HI（homogeneneous immersion）字样, 有的仍刻有 3 物镜中, 油镜的放大倍数和数值孔径 一圈红线或黑线标记,在低倍物镜、 高倍物镜和油镜（numerical apertur

29、e ）最大,而工作距离最短（二）显微镜的辨论率 显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数,更重要的是看它分辩率的大小；辨论率 是指显微镜能辨论出物体两点间最小距离（D）的才能； D 值愈小说明辨论率愈高；D 值与 NA ）成反比；光线的波长（ ）成正比,与物镜的数值孔径（从上式可看出,缩短光波长和增大数值孔径都可提高辨论率；数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角,（n）的乘积； ）的一半正弦与介质折射率影响数值孔径大小的因数,一是镜口角,二是介质的折射率；当镜与装片之间的介质为空气时,由于空气（n= 1.52）的折射率不同,光线会发生折射,不仅使进入物镜的光线削减,降低了视野的照明度,而

30、且会削减镜口角（图 5 2A）；当以香柏油（ n=1.515）为介质时,由于它的折射率与玻璃相近,光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图52B）,不仅增加了视野的照明度,更重要的是通过增加数值孔径达到提高辨论率的目的；可见光的波长平均为 0.55 m；当使用数值孔径为0.65 的高倍镜时,它能辨别两点之间的距离为 0.42 m；而使用数值孔径为 1.25 的油镜时,能辨别两点之间的距离就为 0.22 m；试验 5 细菌的革兰氏染色名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 19 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载目的：初步把握细

31、菌涂片方法及革兰氏染色法步骤；内容： 1制作细菌染色装片；2进行革兰氏染色法操作；二、试验材料和用具苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌 液 12 种；Staphylococcus aureus、大肠杆菌 E.coli 菌液, 待测菌菌革兰氏染色液 结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯；三、操作步骤一制片1涂菌 用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀称、直径约 lcm 的菌膜；涂菌后将接种环火焰灭菌；2干燥 于空气中自然干燥；亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥 温度不宜过高；

32、3固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常用加热法,即将细菌涂片膜向上,通过火焰 染色；二染色3 次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形；此制片可用于l初染 于制片上滴加结晶紫染液,染 l min 后,用水洗去剩余染料；2媒染 滴加卢戈氏碘液,l min 后水洗；依据涂片之厚薄 3脱色 滴加 95%乙醇脱色, 摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 需时 30s 至 l min ,水洗；4复染滴加石炭酸复红液复染l min ,水洗；5滤纸吸干,油镜镜检；三结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成淡红色；四检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色,并绘图、记录染色结果；四、

33、留意事项1. 涂片务求匀称,切忌过厚；2在染色过程中,不行使染液干枯；3脱色时间非常重要,过长,就脱色过度,会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够,就 会使阴性菌被染成阳性菌；4老龄菌因体内核酸削减,会便阳性菌被染成阴性菌,故不能选用；五、试验报吉一绘图 1大肠杆菌革兰氏染色视野图；2金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图；二记录革兰氏染色法法步骤,并进行结果分析；三未知菌的检测结果；六、问题和摸索名师归纳总结 1涂片后为什么要进行固定.固定时应留意什么. 第 9 页,共 19 页2什么是革兰氏染色法.染色过程应留意什么. - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - -

34、- 学习必备 欢迎下载3试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义；试验 6 放线菌的外形观看一、试验目的和内容 目的：辨认放线菌的养分菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的外形；学习放线菌的观看 方法；内容：用水封计法、玻璃纸法、印片法观看放线菌的外形特点；二、试验材料和用具细 黄 链 霉 菌 streptomycs micuoflavus 又 称 Micromonospora echinospora 的玻璃纸培育平皿；0.1%美蓝染色液、石炭酸复红染色液；5406 的 培 养 平 皿 , 棘 孢 小 单 孢 菌盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器；三、操作步骤一观看自然生长状态的

35、放线菌用镊子当心取出用插片法培育的5406 菌培育皿中的一张盖玻片,将其背面附着的菌丝体擦净；然后将长有菌的一面对上放在洁净的载玻片上,用低倍镜、高倍镜观看；找出 3类菌丝及其分生孢子,并绘图；留意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异；二水封片观看取一滴美蓝染色液置于载玻片中心,将用搭片法培育棘孢小单孢菌培育皿中的盖玻片取出,并将有菌面朝下,放在载玻片上,浸在染色液中,制成水封片,用高倍镜观看其单个分生孢子及其基内菌丝,并绘图；三玻璃纸法的镜检观看l直接玻璃纸观看 分别用 5406 和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观看；制片时,于载玻片上放一小滴蒸馏水,将含菌玻璃纸片当心剪下一小块,移至载玻片

36、上, 并使有菌面对上；在玻璃纸与载玻片间不能有气泡,以免影响观看； 将制片于显微镜下观看,先用低倍镜观看菌的立体生长状况,再用高倍镜认真观看；留意区分5406 菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝；观看棘孢小单孢菌时留意把视野调暗,其基内菌丝纤细发亮,其单个分生孢子发暗,直接生长在基内菌丝长出的小梗上；绘图；2印片染色法观看用镊子取洁净载玻片并微微加热,然后用这微热载玻片盖在长有 5406 或棘孢小单孢菌的平皿上,轻轻压一下,留意将载玻片垂直放下和取出,以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然外形；反转有印痕的载玻片微微加热固定用石炭酸复红染色 l min ,水洗,晾干；用油镜观看；绘图

37、；留意比较两种菌的外形特点有何不同；四、留意事项1培育放线菌中要留意,放线菌的生长速度较慢,培育期较长,在操作中应特殊留意 无菌操作,严防杂菌污染；2玻璃纸法培育接种时留意玻璃纸与平板琼脂培育基间不宜有气泡,以免影响其表面 放线菌的生长,3不同观看方法中严格按要求进行,留意菌体的上下位置；五、试验报告1绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观看的放线菌外形；2试比较 5406 菌与棘孢小单孢菌特点的异同；六、问题和摸索名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 19 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习必备 欢迎下载1在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的

38、基内菌丝和气生菌丝 . 2用插片法和搭片法如何制备放线菌标本,其主要优点是什么.可否用此法观看其他微生物 .为什么 . 验；3以玻璃纸掩盖法培育和观看放线菌有何优点 .试用此法设计一个观看青霉菌外形的实注：一插片法和搭片法培育放线菌1插片法1制平板、接种：用冷却至约50的高氏 1 号琼脂培育基倒平板每皿约 20mL ,可用两种方法接菌： 1、先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的 5406 菌孢子, 用平板培育基的一半面积作来回划线接种 接种量可适当加大 ；2、先插片后接种：用平板培育基的另一半面积进行；2插片及培育： 用无菌镊子取无菌盖玻片,在已接种平板上以 45 角斜插入培育基内,插

39、人深度约占盖玻片 1/2 长度 图 11-1A ；同时,在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片,然后接种少量5406 菌孢子至盖玻片一侧的基部,且仅接种于其中心位置约占盖玻片长度的一半左右, 以免菌丝扩散至盖玻片的另一侧；将插片平板倒置于28,培育 37d；2搭片法 1开槽及接种：用无菌打孔器在凝固后的平板培育基上打洞数个,并将棘孢小单孢菌 孢子划线接种至洞内边缘；2搭片及培育： 在接种后的洞面上放一无菌盖玻片,平板倒置于28,培育 37d（图11 1B）；二玻璃纸法固体培育 5406 菌和棘孢小单孢菌 1玻璃纸灭菌 将玻璃纸剪成比培育皿直径略小的片状,将滤纸剪成培育皿大小的 借滤纸将

40、玻璃纸隔开；圆形纸片并稍润湿,然后把 滤纸和玻璃纸交互重叠地放在培育皿中,然后进行湿热灭菌,备用；2制平板及铺玻璃纸取冷凝后的高氏1 号琼脂培育基,用无菌镊子将预先灭菌的块状玻璃纸平铺至平板培育表面,除去；铺玻璃纸时可用无菌涂布器将玻璃纸与培育基之间的气泡3涂布菌液及培育 取 0.l mL 的孢子悬液涂布在铺有玻璃纸的平板培育基表面；接种 平板倒置于 28,培育 57d；试验 7 酵母菌的外形观看一、试验目的和内容 目的：明白自然存在的酵母菌及其外形结构；明白酵母菌产生子囊孢子的条件及其形 态；内容：1观看酵母菌个体外形；2观看酵母菌的假菌丝和繁衍过程；3观看自然状态的酵母菌；二、试验材料和用

41、具酿酒酵母 Saccharomyes cerevisiae、热带假丝酵母Candida tropicalis 斜面菌种；名师归纳总结 PDA 培育基、麦氏McCLary 培育基 醋酸钠培育基、0.05%美蓝染色液 以 pH6.0 的第 11 页,共 19 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 0.02mol/L磷酸缓冲液配制学习必备欢迎下载%孔雀绿, 0.5%沙黄液、 95%乙、碘液、 0.04%的中性红染色液醇；显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环、架的培育皿；三、操作步骤 一酵母菌外形观看 1酵母菌的话体染色观看及死亡率的测定V 形玻璃棒、放置一个

42、三角形玻璃棒支1以无菌水洗下 PDA 斜面培育的酿酒酵母菌苔,制成菌悬液；2取 0.05%美蓝染色液1 滴,置载玻片中心,并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀,染色 2 3min,加盖玻片,在高倍镜下观看酵母菌个体外形,区分其母细胞与芽体,区分死 细胞 蓝色 与活细胞 不着色 ；3在一个视野里计数死细胞和活细胞,共计数 56 个视野；酵母菌死亡率一般用百分数来表示,以下式来运算：死亡率 =死细胞总数 死活细胞总数100% 2酵母菌液泡系的话体观看于洁净载玻片中心加一滴中性红染色液,取少许上述酵母菌悬液与之混合,染色 5min ,加盖玻片在显微镜下观看；细胞无色,液泡呈红色；3酵母菌细胞中肝糖粒的观看将 1 滴碘液置于载玻片中心,接人上述酵母菌悬液,混匀,盖上盖玻片,显微镜观看,细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色；4酵母菌子囊孢子的观看 1活化酿酒酵母：将酿酒酵母接种至新奇的麦芽汁培育基上,置 28C 培育 23d,然 后再移植 23 次；2转接产孢培育基：将活化的酿酒酵母转接至醋酸钠培育基上,置30恒温培育14d；