生产中常用菌种的分离选育和保藏学习教案.pptx

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1、会计学1生产中常用菌种的分离生产中常用菌种的分离(fnl)选育和保选育和保藏藏第一页，共200页。带图象分析带图象分析(fnx)系统的微生物菌种系统的微生物菌种显微观察装置显微观察装置 第1页/共200页第二页，共200页。第一节第一节 菌种的分离菌种的分离(fnl)简介简介 一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；菌种保藏部门索取或购买；菌种保藏部门索取或购买；菌种保藏部门索取或购买；从

2、大自然中分离从大自然中分离从大自然中分离从大自然中分离(fnl)(fnl)筛选新的微生物菌种。筛选新的微生物菌种。筛选新的微生物菌种。筛选新的微生物菌种。第2页/共200页第三页，共200页。二、分离二、分离(fnl)思路思路 n n新新菌菌种种的的分分离离是是要要从从混混杂杂的的各各类类微微生生物物中中依依照照生生产产的的要要求求、菌菌种种的的特特性性，采采用用各各种种(zhzh n n)筛筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。n n实实验验室室或或生生产产用用菌菌种种若若不不慎慎污污染染了了杂杂菌菌，也也必必须须重新进行分离纯化。重新进行

3、分离纯化。n n有有了了优优良良的的菌菌种种，还还要要有有合合适适的的工工艺艺条条件件和和合合理理先进的设备与之配合。先进的设备与之配合。第3页/共200页第四页，共200页。n n定定定定方方方方案案案案：首首首首先先先先要要要要查查查查阅阅阅阅资资资资料料料料，了了了了解解解解所所所所需需需需菌菌菌菌种种种种的的的的生生生生长培养特性。长培养特性。长培养特性。长培养特性。n n采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。采样：有针对性地采集样品。n n增增增增殖殖殖殖：人人人人为为为为地地地地通通通通过过过过控控控控制制制制养养养养分分分分或或或或培培培培

4、条条条条件件件件，使使使使所所所所需需需需菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。菌种增殖培养后，在数量上占优势。n n分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。分离：利用分离技术得到纯种。n n发发发发酵酵酵酵性性性性能能能能测测测测定定定定：进进进进行行行行生生生生产产产产性性性性能能能能测测测测定定定定。这这这这些些些些特特特特性性性性包包包包括括括括形形形形态态态态、培培培培养养养养特特特特征征征征、营营营营养养养养要要要要求求求求、生生生生理理理理生生生生化化化化(shn(shn hu)

5、hu)特特特特性性性性、发发发发酵酵酵酵周周周周期期期期、产产产产品品品品品品品品种种种种和和和和产产产产量量量量、耐耐耐耐受受受受最最最最高高高高温温温温度度度度、生生生生长长长长和和和和发发发发酵酵酵酵最最最最适适适适温温温温度度度度、最最最最适适适适pHpH值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。值、提取工艺等。三、新种分离与筛选三、新种分离与筛选(shixun)的步骤的步骤第4页/共200页第五页，共200页。（一）采样（一）采样(ci yn)1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野

6、果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败(fbi)物品，某些水域等。第5页/共200页第六页，共200页。从自然界筛选从自然界筛选(shixun)第6页/共200页第七页，共200页。n n2 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。n n3 3、采采土土方方式式：在在选选好好适适当当地地点点(ddi(ddi n)n)后后，用用小小萨萨子子除除去去表表土土，取取离离地地面面5-15cm5-15cm处处的的土土约约10g10g，盛盛入入清清洁洁的的牛牛皮皮纸纸袋袋或或塑塑料料袋袋中中，扎扎好好，标标记记，记记录录采采样样时时间间、地地点点(

7、ddi(ddi n)n)、环环境境条条件件等等，以以备备查查考考。为为了了使使土土样样中中微微生生物物的的数数量量和和类类型型尽尽少少变变化化，宜宜将将样样品品逐逐步步分分批批寄寄回回，以以便便及时分离。及时分离。第7页/共200页第八页，共200页。（二）增殖（二）增殖(zngzh)培养培养n n 为为了了容容易易分分离离到到所所需需的的菌菌种种，让让无无关关的的微微生生物物至至少少是是在在数数量量上上不不要要增增加加，可可以以通通过过配配制制选选择择性性培培养养基基，选择一定的培养条件来控制。选择一定的培养条件来控制。n n 例例如如碳碳源源利利用用的的控控制制，可可选选定定糖糖，淀淀粉粉

8、、纤纤维维素素，或或者者石石油油等等，以以其其中中的的一一种种为为唯唯一一碳碳源源，那那么么只只有有利利用用这这一一碳碳源源的的微微生生物物才才能能大大量量正正常常生生长长，而而其其它它微微生生物物就就可可能能死死亡亡或或淘淘汰汰。这这样样对对下下阶阶段段的的纯纯种种(chn(chn zhzh n n)分离就会顺利得多。分离就会顺利得多。第8页/共200页第九页，共200页。（三）培养（三）培养(piyng)分离分离n n 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖培养的选择性控制(kngzh)条件还应进一步应用，而且控制(kngzh)得细一点

9、，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。第9页/共200页第十页，共200页。（四）筛（四）筛 选选n n 这这一一步步是是采采用用与与生生产产相相近近(xin(xin jn)jn)的的培培养养基基和和培培养养条条件件，通通过过三三角角瓶瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。第10页/共200页第十一页，共200页。（五）毒性（五）毒性(d xn)试验试验n n 自自然然界界的的一一些些微微生生物物是是在在一一定定条条件件下下产产毒毒的的，将将其其作作为为生生产产菌菌种种应应当当十十分分当当心心，尤尤其其与与食食品品

10、工工业业有有关关的的菌菌种种，更更应应慎慎重重。据据有有的的国国家家规规定定，微微生生物物中中除除啤啤酒酒酵酵母母、脆脆壁壁酵酵母母、黑黑曲曲霉霉、米米曲曲霉霉和和枯枯草草杆杆菌菌作作为为食食用用无无须须作作毒毒性性试试验验外外，其其他他微微生生物物作作为为食食用用，均均需需通通过过(tnggu)(tnggu)两年以上的毒性试验。两年以上的毒性试验。第11页/共200页第十二页，共200页。第二节第二节 培养培养(piyng)分离分离n n 从从自自然然界界中中分分离离培培养养微微生生物物是是菌菌种种选选育育的的重重要要和和基础的步骤。基础的步骤。n n 到到目目前前为为止止，还还没没有有一一

11、种种分分离离培培养养方方法法能能揭揭示示一一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。个试样中所包含的所有微生物总数和种类。n n在在任任一一试试样样中中所所存存在在的的微微生生物物仅仅为为极极少少数数特特定定种种类类的的菌菌株株；在在工工业业微微生生物物筛筛选选过过程程中中，应应及及时时调调整整检检测测方方法法，以以与与各各种种不不同同类类型型的的生生长长(shngzh(shngzh ng)ng)和和代代谢之微生物相适应。谢之微生物相适应。n n因因此此，建建立立一一更更为为科科学学的的和和针针对对性性不不强强的的分分离离方方法法是必要的。是必要的。第12页/共200页第十三页，共200页。一、

12、成功的分离培养一、成功的分离培养(piyng)方法方法(1)(1)认真考它所需产品的特征和生产过程；认真考它所需产品的特征和生产过程；(2)(2)制订初步的筛选标准；制订初步的筛选标准；(3)(3)将生态学方法运用将生态学方法运用(ynyng)(ynyng)到分离和筛选过程。到分离和筛选过程。第13页/共200页第十四页，共200页。二、培养分离中要解决二、培养分离中要解决(jiju)的问题的问题1 1、“分离什么和从哪里分离出分离什么和从哪里分离出?”?”2 2、必必须须充充分分考考虑虑所所分分离离微微生生物物的的生生产产能能力力、生生长长速速度度、生生物物群群体体培培养养(piy(piy

13、ng)ng)和和产产品品生生产产工工艺艺及及其其提提纯纯的的难难易易和和费费用用，工工业业生生产产发发酵酵罐罐中中稳稳定定性及遗传操作的难易程度等。性及遗传操作的难易程度等。3 3、选择适宜的培养、选择适宜的培养(piy(piy ng)ng)分离方法和检测方法。分离方法和检测方法。第14页/共200页第十五页，共200页。三、将生态学方法用于培养分离三、将生态学方法用于培养分离(fnl)的一般思的一般思路要点路要点n n1 1罗列出所要分离的微生物类群；罗列出所要分离的微生物类群；n n2 2根根据据所所采采集集样样本本的的各各种种生生态态参参数数，描描述述(mio(mio sh)sh)所所要

14、分离的微生物之生态系统或栖息地：要分离的微生物之生态系统或栖息地：n n3 3将将若若干干样样本本分分成成若若干干类类型型，如如植植物物和和植植物物各各部部，土土壤壤(类型和土层类型和土层)、岩石、水、昆虫和发酵食品等；、岩石、水、昆虫和发酵食品等；n n4 4罗罗列列出出所所要要考考察察和和测测量量的的环环境境参参数数，如如pHpH、盐盐分分、水分、氧化还原电势及温度等；水分、氧化还原电势及温度等；第15页/共200页第十六页，共200页。5 5列出生物系统中有用的自然列出生物系统中有用的自然(zrn)(zrn)底物，如底物，如森林土壤中的几丁质、葡萄表皮的果胶；森林土壤中的几丁质、葡萄表皮

15、的果胶；6 6根据上述根据上述1-51-5项中所获得的数据，设计分离方项中所获得的数据，设计分离方法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然法，即选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条件；浸出汁和培养条件；7 7用标准方法作对照来评价生态学分离方法；用标准方法作对照来评价生态学分离方法；8 8根据待检材料的生态参数需要，修改已知的根据待检材料的生态参数需要，修改已知的方法；方法；9 9运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛运用特定的富集方法，富集那些可能具有筛选意义的微生物类群。选意义的微生物类群。第16页/共200页第十七页，共200页。四、自然界中细菌四、自然界中细菌(xjn)的分

16、离的分离第17页/共200页第十八页，共200页。(一一)采样和采集采样和采集(cij)方法方法n n为为了了从从一一特特定定生生态态系系统统中中分分离离出出具具有有代代表表性性的的细细菌菌菌菌群群，特特别别是是分分离离那那些些在在唯唯一一微微环环境境区区域域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。n n样样本本采采集集时时所所需需的的工工具具通通常常有有无无菌菌刮刮铲铲、土土样样采采集集器器、镊镊子子(ni(ni zi)zi)、解解剖剖刀刀、手手套套、无无菌菌小小塑料袋和塑料瓶等。塑料袋和塑料瓶等。第18页/共200页第十九页，共200页。采样采样(c

17、i yn)的注意事项的注意事项1 1、采样时应尽可能保持相对无菌；、采样时应尽可能保持相对无菌；2 2、所采集的样本必须具有某种代表性；、所采集的样本必须具有某种代表性；3 3、采采好好的的样样必必须须完完整整地地标标上上样样本本的的种种类类及及采采集集日日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4 4、应应充充分分考考虑虑采采样样的的季季节节性性和和时时间间(shjin)(shjin)因因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；第19页/共200页第二十页，共200页。n n5 5、采好的样应及时处理、采好的

18、样应及时处理(chl)(chl)，暂不能处理，暂不能处理(chl)(chl)的也应贮存于的也应贮存于44下，但贮存时间不宜下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长消长第20页/共200页第二十一页，共200页。1土样采集土样采集(cij)方法方法n n森森林林、旱旱地地，草草地地可可先先掘掘洞洞，由由土土壤壤下下层层向向上上层层顺顺序序采采集；集；n n水水田田等等浸浸水水土

19、土壤壤在在不不损损土土层层结结构构的的情情况况下下插插入入圆圆筒筒采采集集。如如果果层层次次要要求求不不严严格格，可可取取离离地地面面5 515cm15cm处处的的土土。将将采采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。n n在在采采集集植植物物根根际际土土样样时时，一一般般方方法法是是自自土土壤壤中中慢慢慢慢拔拔出出(b(b ch)ch)植植物物根根，在在大大量量无无菌菌水水中中浸浸渍渍约约20min20min，洗洗去去粘粘附附在在根根上上的的土土壤壤，然然后后再再用用无无菌菌水水漂漂洗洗下下根根部部残残留留的的土土，这部分上却为根际土样。这部分上却为根际土样。第2

20、1页/共200页第二十二页，共200页。2 2植物体采集植物体采集(cij)(cij)方法方法n n 在在采采集集叶叶面面时时，一一般般是是用用灭灭菌菌的的剪剪刀刀、打打孔孔器器、安安全全刀刀片片等等，由由几几片片新新鲜鲜叶叶片片的的同同一一(tngy)(tngy)部部位位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。n n选选择择叶叶面面时时应应考考虑虑叶叶位位、叶叶龄龄、叶叶片片正正反反面面和和在在一片叶上的取样部位。一片叶上的取样部位。n n采采集集植植物物根根及及根根系系时时，方方法法与与根根际际土土样样采采集集方方法法相相似似。将将洗洗净净的的根根装装入入采

21、采样样袋袋中中，采采集集根根系系时时，一般与根际土样一起保存。一般与根际土样一起保存。第22页/共200页第二十三页，共200页。3水样采集水样采集(cij)方方法法n n用用于于细细菌菌检检测测的的水水样样应应收收集集于于100m1100m1干干净净、灭灭菌菌的的广口塑料瓶中。广口塑料瓶中。n n由由于于表表层层水水中中含含有有泥泥沙沙，故故在在采采样样时时应应在在较较深深的的静静水层中采集水样。水层中采集水样。n n方方法法是是：握握住住采采样样瓶瓶底底浸浸入入水水中中30-50cm30-50cm处处，然然后后瓶瓶口口(pn(pn k k u)u)朝朝下下打打开开瓶瓶盖盖，让让水水样样进进

22、入入。如如果果有有急急流流存存在在的的话话，应应直直接接将将瓶瓶口口(pn(pn k k u)u)反反向向于于急急流流。采采集集瓶瓶从从水水中中取取出出时时应应迅迅速速并并带带有有较较大大的的弧弧度度。水水样样不不应应装装满满采采样样瓶瓶。所所有有水水样样都都应应在在24h24h之之内迅速进行检测，或者内迅速进行检测，或者4 4下贮存。下贮存。第23页/共200页第二十四页，共200页。(二二)生态学参数及培养基生态学参数及培养基的组成的组成(z chn)(z chn)原则原则1 1、加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物种种类类和和用用量量、环环境境生生物物物物理理学学参参数数以以

23、及及用用于于平平板板涂涂布布分分离离样样本本的的溶溶剂剂都都会会影影响响实验中所要分离的细菌的数量和种类。实验中所要分离的细菌的数量和种类。2 2、就就分分离离培培养养基基的的组组成成(z(z chnchn)而而言言，部部分分培培养养基基中中必必须须含含有有10-50%10-50%的的天天然然提提取取物物。加加入入培培养养基基中中的的天天然然提提取取物物，部部分分培培养养基基中中则则应应含含有有多多种种碳碳、氮氮源源，如如几几丁丁质、纤维素或果胶。质、纤维素或果胶。第24页/共200页第二十五页，共200页。3 3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌如

24、放线菌酮和制霉素酮和制霉素)，掺加浓度一般为，掺加浓度一般为50g50gm1m1，以以抑制真菌的生长。抑制真菌的生长。4 4、琼脂、琼脂(qingzh)(qingzh)平板在使用前应置于平板在使用前应置于3737培养箱培养箱中孵育中孵育l l、2 2天。天。5 5、培养基的生物物理学参数，如、培养基的生物物理学参数，如pHpH及盐分也应调及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。节到与试样的生态系统参数值相近。第25页/共200页第二十六页，共200页。土中细菌的富集培养土中细菌的富集培养(piyng)与分离与分离n n 分离土样中的大部分细菌的分离程序(chngx)中无需进行富集。n n但

25、对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。第26页/共200页第二十七页，共200页。富集方法富集方法(fngf)(fngf)n n运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质物及生长因子的前体物质(wzh)(wzh)来激活细菌某一特殊基因组，可来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。以建立起若干富集技术。n n富集可以促进抗性的产生并维持下来。富集可以促进抗性的产生并维持下来。第27页/共200页第二十八页，共200页。n n土样中细菌的富集：适度稀释后，取土样中细菌的富集

26、：适度稀释后，取0.1m10.1m1涂布已涂布已添加及未添加富集底物添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等如几丁质、纤维素等)的的土浸出汁平板。土浸出汁平板。n n植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取适度培养取样，洗涤，取1ml1ml经适度稀释后涂布经适度稀释后涂布平板。平板。n n水中细菌的分离：水样通过水中细菌的分离：水样通过0.22m0.22m无菌滤膜，取无菌滤膜，取出滤膜用出滤膜用1ml1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积无菌稀释液将滤膜上的沉积(chnj)(chnj)洗下。用样本稀释液适度稀释洗下。用样本稀释液适度稀释

27、,涂布平涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。板倒置培养或滤纸压印分离法。第28页/共200页第二十九页，共200页。水中细菌分离水中细菌分离(fnl)(fnl)的简易富集的简易富集技术技术n n 在在无无菌菌的的、用用棉棉团团塞塞好好的的广广口口三三角角烧烧瓶瓶中中连连续续培培养养，定定期期取取样样涂涂布布适适宜宜(shy)(shy)分分离离琼琼脂脂平平板板上；上；n n在在不不同同水水体体的的水水样样中中加加入入一一定定的的底底物物如如蔗蔗糖糖、多多糖糖及及蛋蛋白白质质等等，同同样样可可以以促促进进水水中中微微生生物物的的增殖。增殖。n n培培养养过过程程中中可可加加入入低低浓浓度度的的抗抗真

28、真菌菌剂剂以以抑抑制制真真菌的生长。菌的生长。n n另另一一富富集集方方法法是是在在培培养养烧烧瓶瓶中中添添加加细细菌菌“附附着着材料材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。，如无菌的植物组织或土壤浸出液。n n通通过过改改变变培培养养温温度度和和培培养养周周期期可可选选择择性性富富集集嗜嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。第29页/共200页第三十页，共200页。次代培养及纯化次代培养及纯化(chn hu)(chn hu)步骤步骤 1 1、涂涂布布的的平平板板经经培培养养后后，如如生生长长(shngzh(shngzh ng)ng)出出菌菌落落，则则按按涂涂布布不不同同稀稀

29、释释度度的的稀稀释释液液所所得得的的单单菌菌菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2 2、用用无无菌菌牙牙签签将将菌菌落落转转接接到到筛筛选选平平板板上上及及转转接接至至添添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3 3、筛筛选选平平板板经经培培养养后后，按按生生长长(shngzh(shngzh ng)ng)出出菌菌落落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4 4、将将认认为为有有希希望望的的菌菌落落用用牙牙签签转转接接到到另另一一模模拟拟分分离离琼脂平板上进行筛选。琼脂平板

30、上进行筛选。第30页/共200页第三十一页，共200页。五、放线菌的分离五、放线菌的分离(fnl)(fnl)n n(一一)采样及采集采样及采集(c(c ij)ij)方法方法n n应尽可能实行无菌操作。应尽可能实行无菌操作。n n所采集所采集(c(c ij)ij)的样本应具有一定的代表性。的样本应具有一定的代表性。n n样本采集样本采集(c(c ij)ij)完后，应及时处理或在完后，应及时处理或在4 4下贮存，贮存试样处应与划线，筛下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。选平板分开，贮存时间不宜过长。第31页/共200页第三十二页，共200页。(二二)生态学参数生态学参数(c

31、nsh)n n 放放线线菌菌分分离离培培养养过过程程中中所所需需考考虑虑的的生生态态参参数数有有温温度度、pHpH、离离子子强强度度(qingd)(qingd)、氧氧化化还还原电势和底物浓度。原电势和底物浓度。第32页/共200页第三十三页，共200页。（三）培养基的组成（三）培养基的组成(z chn)(z chn)原则原则n n大大多多数数放放线线菌菌的的分分离离培培养养是是在在贫贫脊脊或或复复杂杂底底物物的的琼琼脂脂平平板板上上进进行行(jnxng)(jnxng)的的。除除嗜嗜温温性性放放线线菌菌外外，其其他他放放线线菌菌一一般般在在培培养养4-204-20天天内内在在分分离离平平板板上上

32、缓缓慢慢形形成成菌菌落。落。n n在在放放线线菌菌分分离离琼琼脂脂中中通通常常都都加加入入抗抗真真菌菌剂剂制制霉霉菌菌素素或或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。n n选择性地添加抗生素。选择性地添加抗生素。n n分分离离琼琼脂脂平平板板制制备备好好后后，一一般般皆皆应应在在3737培培养养箱箱中中存存放放3 3天。天。第33页/共200页第三十四页，共200页。放线菌的分离放线菌的分离(fnl)(fnl)n n土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。无菌海绵压印土样后压印平板后培养。n n植

33、物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。养。也可洗下微生物后振荡培养。n n水中放线菌的分离：水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤(gul(gul)，取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。取离心沉积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。第34页/共200页第三十五页，共200页。次代培养次代培养(piyng)(piyng)及纯化及

34、纯化n n菌菌落落形形成成后后可可根根据据肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落形形态态上上的的差差异异，作作初步的鉴定和区分。初步的鉴定和区分。n n通通过过高高倍倍放放大大进进行行镜镜检检，可可了了解解气气生生和和营营养养孢孢子子形形成成情况。情况。n n成成功功地地分分离离出出各各种种不不同同的的放放线线菌菌属属及及种种的的关关键键是是所所采采集集样样本本的的本本身身及及其其分分离离用用的的琼琼脂脂培培养养基基；而而肉肉眼眼识识别别不不同同的的生生长长形形态态、从从而而(cng(cng r)r)初初步步地地加加以以鉴鉴定定，在在分离放线菌时显得尤为重要。分离放线菌时显得尤为重要。n n将将分分离离

35、平平板板上上所所形形成成的的菌菌落落用用经经火火焰焰灼灼烧烧灭灭菌菌的的钩钩形形针针或或无无菌菌牙牙签签挑挑取取，点点接接到到琼琼脂脂平平板板上上进进行行影影印印培培养养，以进一步筛选和分离。以进一步筛选和分离。第35页/共200页第三十六页，共200页。六、真菌六、真菌(zhnjn)(zhnjn)分离分离1 1、利利用用低低碳碳氮氮比比的的培培养养基基可可使使真真菌菌生生长长菌菌落落分分散散，利利于于计计数数，分分离离和和鉴鉴定定(jindng)(jindng)。这这里里主主要要是是利利用用营营养养成成分分的的减减少少而而使使生生长长减减慢慢，并并由此限制真菌的迁涉生长。由此限制真菌的迁涉生

36、长。2 2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3 3、有有时时，真真菌菌子子实实体体形形成成必必须须有有光光线线，这这在在分分离离培养时应加以考虑。培养时应加以考虑。第36页/共200页第三十七页，共200页。4 4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为分离镰刀菌；也可以

37、是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。维素的纤维素裂解微生物。5 5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度定程度(chngd)(chngd)。在分离培养基中加入一定的抗生素。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。第37页/共200页第三十八页，共200页。真菌真菌(zhnjn)(zhnjn)的分离方法的分离方法n n土土中中真真菌菌的的分分离离：稀稀释释法法，混混入入

38、法法，压压贴贴法法，粘粘附附法法，浮浮选选法法，注注射射器器采采集集法法，土土过过筛筛法法，庶糖密度梯度离心法。庶糖密度梯度离心法。n n植植物物材材料料中中真真菌菌的的分分离离：植植入入法法，压压贴贴法法，洗洗涤法，浸泡法。涤法，浸泡法。n n水水中中真真菌菌的的分分离离：水水样样稀稀释释后后涂涂布布分分离离。饵饵诱诱技术常用技术常用(chn(chn yn yn)于水中真菌的富集。于水中真菌的富集。n n子子实实体体直直接接分分离离培培养养担担子子菌菌：新新采采集集的的子子实实体体组组织织植植入入平平板板内内或或在在放放于于液液体体培培养养基基表表面面放放一一小块无菌滤纸上培养。小块无菌滤纸

39、上培养。第38页/共200页第三十九页，共200页。七、生产七、生产(shngchn)(shngchn)选种选种n n 是是在在长长年年累累月月的的生生产产实实践践中中，在在培培养养工工艺艺条条件件没没有有任任何何可可见见变变更更情情况况下下，突突然然发发现现某某些些批批次次生生产产水水平平提提高高较较大大，这这就就有有可可能能是是个个别别自自然然变变异异朝朝更更好好的的方方向向变变的的细细胞胞，在在这这种种条条件件下下很很适适应应于于培培养养条条件件，并并逐逐渐渐显显示示出出它它的的生生长长优优势势，这这种种优优势势的的发发展展，促促使使它它优优良良的的生生产产性性能能表表露露。进进行行类类

40、似似新新种种筛筛选选分分离离，达达到到(d(d do)do)获获得得新新的的优良生产菌种的目的。优良生产菌种的目的。第39页/共200页第四十页，共200页。第三节第三节 工业工业(gngy)(gngy)菌种的育种方针菌种的育种方针n n工业菌种的育种：工业菌种的育种：n n 是是运运用用遗遗传传学学原原理理和和技技术术对对某某个个用用于于特特定定生生物物技技术术目目的的的的菌菌株株进进行行的的多多方方位位的的改改造造。通通过过改改造造，可可使使现现存存的的优优良良性性状状强强化化，或或去去除除(q(q ch)ch)不不良性质或增加新的性状。良性质或增加新的性状。第40页/共200页第四十一页

41、，共200页。工业菌种育种工业菌种育种(y zhng)(y zhng)的方法的方法n n诱变n n基因转移(zhuny)n n基因重组第41页/共200页第四十二页，共200页。育种育种(y zhng)(y zhng)过程过程n n包括下列包括下列3 3个步骤：个步骤：n n(1)(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。n n(2)(2)希望基因型的选出。希望基因型的选出。n n(3)(3)改良改良(g(g iling)iling)菌种的评价菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模包括实验规模和工业生产规模)。第42页/共200页第四十三页，

42、共200页。选择育种方法时综合考虑选择育种方法时综合考虑(kol)(kol)的因的因素素 (1)(1)待待改改良良性性状状的的本本质质及及与与发发酵酵工工艺艺的的关关系系(如如批批式式或连续发酵试验或连续发酵试验)；(2)(2)对对这这一一特特定定菌菌种种的的遗遗传传和和生生物物化化学学万万面面认认识识的的明了程度；明了程度；(3)(3)经济经济(jngj)(jngj)费用。费用。如如果果对对特特定定菌菌种种的的基基本本性性状状及及其其工工艺艺知知晓晓甚甚少少，则则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：多半采用随机诱变、筛选及选育等技术：如如果果对对其其遗遗传传及及生生物物化化学学方方面面的的性

43、性状状已已有有较较深深的的认认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。第43页/共200页第四十四页，共200页。工业工业(gngy)(gngy)菌种改良方法菌种改良方法 (1)(1)解解除除或或绕绕过过代代谢谢途途径径中中的的限限速速步步骤骤：通通过过增增加加特特定定基基因因的的拷拷贝贝数数或或增增加加相相应应基基因因的的表表达达能能力力来来提提高高限限速速酶酶的的含含量量；在在代代谢谢裔裔途途径径中中引引伸伸出出新新的的代代谢谢步步骤骤，由由此此提提供供一一个旁路个旁路(pn(pn l)l)代谢途径。代谢途径。(2)(2)增加前体物的浓度。增加前体物

44、的浓度。(3)(3)改改变变代代谢谢途途径径，减减少少无无用用副副产产品品的的生生成成以以及及提提高高菌菌种种对对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。第44页/共200页第四十五页，共200页。(4)(4)抑制或消除抑制或消除(xioch)(xioch)产品分解酶。产品分解酶。(5)(5)改进菌种外泌产品的能力。改进菌种外泌产品的能力。(6)(6)消消除除(xioch)(xioch)代代谢谢产产品品的的反反馈馈抑抑制制。如如诱诱导导代代谢谢产产品品的的结结构构类类似似物抗性。物抗性。第45页/共200页第四十六页，共200页。提高提高(t

45、 go)特定基因特定基因的表达水平的表达水平n n(1)(1)引引入入强强转转录录及及翻翻译译信信号号，可可通通过过在在一一高高效效表表达达载载体体上上克克隆隆靶靶基基因因(jyn)(jyn)；在在靶靶基基因因(jyn)(jyn)的的上上游游引引入入强强启启动动子子；修修改改现现有有表表达达信信号号，提提高高基基因因(jyn)(jyn)效力等。效力等。n n(2)(2)诱导解除基因诱导解除基因(jyn)(jyn)表达抑制的突变。表达抑制的突变。第46页/共200页第四十七页，共200页。改进菌种的生长改进菌种的生长(shngzhng)效效率率n n提高提高(t go)(t go)菌株对底物的利

46、用率方法：菌株对底物的利用率方法：n n a.a.通过确定并改变代谢中的耗能部分通过确定并改变代谢中的耗能部分;n n b.b.由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。由另一菌株的高效低能代谢途径代谢来实现。n n c.c.赋赋予予菌菌种种对对多多种种底底物物，特特别别是是价价廉廉而而丰丰富富的的底底物物的的利利用用能能力力，由由此此可降低操作费用。可降低操作费用。第47页/共200页第四十八页，共200页。第四节第四节 诱变诱变(yu bin)(yu bin)育种育种n n以以微微生生物物的的自自然然变变异异作作为为基基础础的的生生产产选选种种的的机机率率并并不不很很高高，一一个个基因的自然

47、突变频率仅基因的自然突变频率仅10-6-10-1010-6-10-10左右。左右。n n诱诱变变育育种种：以以诱诱发发突突变变为为基基础础的的育育种种，是是迄迄今今为为止止国国内内外外提提高高菌菌种产量种产量(ch(ch nling)nling)、性能的主要手段。、性能的主要手段。第48页/共200页第四十九页，共200页。诱变诱变(yu bin)物理、化学或生物物理、化学或生物(shngw)诱变诱变方法方法第49页/共200页第五十页，共200页。一、诱变一、诱变(yu bin)剂剂和诱变和诱变(yu bin)处理处理n n 物物理理诱诱变变剂剂：射射线线如如紫紫外外线线、XX射射线线、射射

48、线，快中子；线，快中子；n n物物理理因因素素中中目目前前使使用用得得最最方方便便而而且且十十分分有有效效的的是是紫紫外外线线。许许多多(x(x du)du)高高产产菌菌株株的的选选育育都都用用过过紫紫外外线线，对对于于一一般般实实验验室室、中中小小型型工工厂厂都都适适用用，也很安全。也很安全。n n其其他他的的几几种种射射线线都都是是电电离离性性质质的的，有有一一定定的的穿穿透透力力，一一般般都都由由专专业业人人员员在在专专门门的的设设备备中中使使用用，否则有一定危险性。否则有一定危险性。第50页/共200页第五十一页，共200页。化学诱变剂：化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、化学因子如碱基

49、类似物、55氟尿嘧啶、烷化剂等。氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用化学诱变剂中使用(shyng)(shyng)最多、最有效的是烷化剂。最多、最有效的是烷化剂。使用使用(shyng)(shyng)化学诱变剂的优缺点：化学诱变剂的优缺点：1 1、大大多多数数情情况况下下，就就突突变变数数量量而而言言，要要比比电电离离辐辐射射更更有效。有效。第51页/共200页第五十二页，共200页。2 2、化化学学诱诱变变剂剂是是很很经经济济的的，因因为为只只需需要要少少量量的的合合适适的的诱诱变变剂剂，设设备备是是实实验验室室的的一一般般玻玻璃璃器器皿皿，一一个个蒸蒸气气罩罩。而而用用电电离离辐辐射射行行工工

50、作作时时，设备费用大，并要注意安全性。设备费用大，并要注意安全性。3 3、大大部部分分诱诱变变剂剂是是致致癌癌剂剂，所所以以(suy)(suy)在在使使用用中中必必须须非非常常谨谨慎慎，要要避避免免化化学学诱诱变变剂剂与与皮皮肤肤接接触触，且且切切勿勿吸吸入入其其蒸蒸气气，有有人人对对某某些些诱诱变变剂剂极极其其敏敏感感，甚甚至至未未直直接接接接触触就就会会过过敏敏，这就更要当心。这就更要当心。第52页/共200页第五十三页，共200页。诱变剂的选择诱变剂的选择(xunz)(xunz)1 1碱碱基基类类似似物物和和羟羟胺胺具具有有很很高高的的特特异异性性，但但很很少少使使用用(shyng)(s