实验六过氧化氢酶米氏常数Km的.pptx

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1、一、实验目的学习米氏常数（Km）的测定方法。第1页/共14页 二、实验原理过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：2H2O22H2O+O2 H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。2KMnO45H2O23H2SO4 2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。第2页/共14页米氏常数的测定：双倒数作图法（米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Lineweaver-BurkBurk法）法）1 KmKm 1 1 =.+v Vmax S Vmax 第3页/共14页三、试剂 1草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于10

2、0105烘12h。冷却后，准确称取，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。2约0.02ml KMnO4储存液 称取，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。第4页/共14页3应用液 取草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成，每次稀释都必须重新标定储存液。4约液 取20%H2O2（AR）40ml于量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用标定之，

3、稀释至所需浓度。5磷酸盐缓冲液（）。第5页/共14页四、操作步骤 l血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液，用磷酸盐缓冲液，0.2mol/L)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。2H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为的H2O2和25%H2SO4，分别用4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。第6页/共14页3反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。第7页/共14页加入物加入物(ml)12345H2O2(约约0.05mol/L)0.51.52.53.54.5蒸馏水蒸馏水 4.03.02.01.0血液稀释液血液稀释液0.50.

4、50.50.50.537度保温度保温5分钟分钟25硫酸硫酸2.02.02.02.02.00.004高锰酸钾高锰酸钾第8页/共14页依次加入1：1500稀释血液每瓶，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。第9页/共14页五、计算 1.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。反应速度=加入的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数即：H2O2 mol浓度加入的毫升数KMnO4 0.004 mol/L消耗的KMnO4毫升数 5/2（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中m

5、ol换算系数）第10页/共14页2求Km值：下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。己知KMnO4为，标定出H2O2浓度为，列表计算如下：第11页/共14页计算程序计算程序12345加人加人H2O2数数0.501.001.502.002.50加人加人H2O2mmol=0.080.040.080.120.160.20底物浓度底物浓度S=50.010.020.030.040.05酶作用后，酶作用后，KMnO4滴定滴定ml1.353.706.409.8013.20剩余剩余H2O2mmol=0.0045/20.01350.0370.0640.0980.132反应速度反应速度V=一一0.02650.0430.0560.0620.068按前述方法作图求得Km10-2mol/L。第12页/共14页六、思考题lKm值的意义是什么？2测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？第13页/共14页感谢您的观看！第14页/共14页