微生物发酵产酶.pptx

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1、Contents of chapter 21、酶生物合成过程2、常见产酶微生物3、酶的发酵工艺条件及控制4、酶生产过程的动力学GoGoGoGo第1页/共102页酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea organ/tissue/cellAmylase from BacillusProtease from BacillusPhosphatase from BacillusGlucoamylase from Aspergillu

2、sPlant cell cultureAnimal cell cultureFew example第2页/共102页微生物发酵产酶微生物发酵产酶酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。大多数酶的生产采用发酵生产原因：微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点第3页/共102页微生物发酵产酶微生物发酵产酶优良的产酶微生物具备的条件：（1）酶的产量高；（2）产酶稳定性好；（3）容易培养和管理；（4）利于酶的分离纯化；（5）安全可靠、无毒性等。第4页/共102页微生物发酵产酶微生物发酵产酶酶的发酵生产的方式：固体培养发酵液体深层发酵固定化微生物

3、细胞发酵固定化微生物原生质体发酵第5页/共102页微生物发酵产酶微生物发酵产酶酶生物合成的基本理论蛋白类酶和核酸类酶酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程.合成过程:酶的基因（DNA）（转录）RNA（翻译）多肽链（加工、组装）蛋白质第6页/共102页酶生物合成过程 The biosynthesis process of Enzyme1、中心法则-Central Dogma 2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白质的生物合成-Translation4、酶生物合成的调节-RegulationGoGoGoGo第7页/共102页Reverse transcription1

4、、中心法则-Central Dogma 第8页/共102页2、RNA的生物合成(转录)-Transcription细胞内RNA的生物功能 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。第9页/共102页3 3、蛋白质的合成(翻译)-)-TranslationTranslation翻译:以RNARNA中mRNAmRNA为模板,按照其 核苷酸顺序所组成的密码指

5、 导蛋白质的合成的过程.mRNAmRNA蛋白质翻译 各种信息 各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）第10页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出的操纵子学说（Operon theory）来阐明的。第11页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述操纵子（操纵子（OperonOperon）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中）：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因。包括结构基因，调节基因，操纵

6、基因和启动基因。第12页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述启启动动基基因因（Promoter Promoter genegene）：由由两两个个位位点点组组成成，一一个个是是RNARNA聚聚合合酶酶的的结结合合位位点点，另另一一个个是是环环腺腺苷苷酸酸（cyclic cyclic AMP,AMP,cAMPcAMP）与与CAPCAP组成的复合物组成的复合物 (cAMP-CAP)(cAMP-CAP)的结合位点。的结合位点。操操纵纵基基因因（Operator Operator genegene）：与与调调节节基基因因产产生生的的变变构构蛋蛋白白（阻阻遏遏蛋蛋白白

7、）中中的的一一种种结结构构结结合合，从从而而操操纵纵酶酶生生物物合合成成的的时时机机和和合合成速度。成速度。第13页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述调节基因（调节基因（Regulator geneRegulator gene）:产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白产生一种阻遏蛋白。阻遏蛋白是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子是一种由多个亚基组成的变构蛋白，它可以通过与某些小分子效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改效应物（诱导物或阻遏物）的特异结合而改变其结构，从而改变它与操纵基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由变它与操纵

8、基因的结合力。当阻遏蛋白与操纵基因结合时，由于空间排挤作用，于空间排挤作用，RNARNA聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，聚合酶就无法结合到启动基因的位点上，也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法也无法进行结构基因的位置进行转录，酶的生物合成也就无法进行。进行。第14页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述结构基因（结构基因（Strutural geneStrutural gene）：结构基因与多肽链有各自的对）：结构基因与多肽链有各自的对应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为应关系。结构基因上的遗传信息可以转录成为mRNAmRNA上的遗传

9、密上的遗传密码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条码，再经翻译成为酶蛋白的多肽链，每一个结构基因对应一条多肽链。多肽链。第15页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述诱导型操纵子（诱导型操纵子（Inducible operonInducible operon）大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子第16页/共102页酶生物合成的调节原核生物中酶生物合成的调节机制操纵子学说概述阻遏型操纵子（阻遏型操纵子（Repressible operonRepressible operon）色氨酸操纵子色氨酸操纵子 (Trp(Trp operon)operon)

10、色色氨氨酸酸操操纵纵子子(tryptophane(tryptophane operon)operon)负负责责色色氨氨酸酸的的生生物物合合成成，当当培培养养基基中中有有足足够够的的色色氨氨酸酸时时，这这个个操操纵纵子子自自动动关关闭闭，缺缺乏乏色色氨氨酸酸时时操操纵纵子子被被打打开开，trptrp基基因因表表达达，色色氨氨酸酸或或与与其其代代谢谢有有关关的的某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。某种物质在阻遏过程（而不是诱导过程）中起作用。第17页/共102页第18页/共102页酶生物合成的调节真核生物酶生物合成的调节目前为止，还没有统一的理论和模型来阐述真核生物酶生物合成的调节规律。

11、第19页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。第20页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganis

12、m in Enzyme ProductionEnzyme Production1、细菌细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。第21页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production1、细菌细菌属于真细菌纲细菌属于真细菌纲(SchizomycetesSchizomycetes)，是单细胞，是单细胞，横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后横分裂或二分裂繁殖，依细胞的形状和分裂后的集合状态而给予各种名称

13、。按形状分为球菌、的集合状态而给予各种名称。按形状分为球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、杆菌、螺旋菌等。球菌又有单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌等。第22页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production 球菌 链球菌第23页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme Production

14、Enzyme Production 四联球菌 葡萄球菌第24页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production 杆菌 螺旋菌第25页/共102页(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.51.01.03.0 um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名

15、声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和 制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等第26页/共102页(2)(2)醋酸杆菌（AcetobacterAcetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）、葡萄糖异构酶(高果糖浆 )、山梨糖(维C中间体）第27页/共102页(3)(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBacillu

16、s subtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。第28页/共102页常用的产酶微生物放线菌(actinomycetes)放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌(Streptomyces)。链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径0.21.2m。革兰氏染色阳性。菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。链霉菌是生产葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶的主要微生物。还可以用于生产

17、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16羟化酶，可用于甾体转化。第29页/共102页常用的产酶微生物放线菌链霉菌属 诺卡氏菌属第30页/共102页常用的产酶微生物放线菌 诺卡氏菌属多为需氧型腐生菌，少数厌氧型寄生菌。已报道有100余种，主要分布于土壤。许多种能产生抗生素，如利福霉素（rifomycin）等，有的用于石油脱蜡，烃类发 酵 及 污 水 处 理 等。第31页/共102页常用的产酶微生物放线菌链霉菌属主要分布于含水量较低，有机质丰富的中性或微碱性土壤中，多数为腐生，好氧菌。已知放线菌所产抗生素的90由本属产生。第32页/共102页常见产酶

18、微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production2、霉菌霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等。第33页/共102页曲霉(AspergillusAspergillus)分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.NigerAsp.Niger、黄曲霉Asp.flavusAsp.flavus应用：

19、是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。回本节第34页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production黑曲霉黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如，糖化酶，-淀粉酶,酸性蛋白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，

20、脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶，核苷酶等。第35页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production第36页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production 米曲霉(Aspergillus oryzae)米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分分生生孢孢子子头头呈呈放放射射形形，顶囊球形或瓶形，

21、小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达2 mm 左右，粗糙。米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P等。第37页/共102页第38页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production红曲霉（Monascus）红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在

22、菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含8个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子则留在闭囊壳内。红曲霉可用于生产-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。第39页/共102页第40页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production青霉(Penicillium)青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形或短

23、柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。青霉菌种类很多，其中产黄青霉（Penicillium chrysogenum）用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。桔青霉（Penicillium cityrinum）用于生产5-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。第41页/共102页第42页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzy

24、me Production木霉(Trichoderma)木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝，分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙，透明或亮黄绿色。木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的17-羟化酶，常用于甾体转化。第43页/共102页第44页/共102页常见产酶微生物 Common mi

25、croorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production 根霉(Rhizopus)根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或不规则形状。根霉可用于生产糖化酶、-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的11-羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。第45页/共102页第46页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in C

26、ommon microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production毛霉(Mucor)毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般单生，分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶。毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。第47页/共102页第48页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production酵母酵母酵母是一群

27、属于真菌的单细酵母是一群属于真菌的单细胞微生物。它分为两大类胞微生物。它分为两大类:一类能产生子囊孢子，称为一类能产生子囊孢子，称为真酵母；另一类不能生成子真酵母；另一类不能生成子囊孢子，称为类酵母。通常囊孢子，称为类酵母。通常以出芽方式进行无性繁殖，以出芽方式进行无性繁殖，也有少数酵母进行有性繁殖。也有少数酵母进行有性繁殖。细胞形状因菌株而异，有球细胞形状因菌株而异，有球形、卵园形、柠檬形、梨形、形、卵园形、柠檬形、梨形、腊肠形、也有丝状。大小一腊肠形、也有丝状。大小一般为般为1 130m30m。第49页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common

28、 microorganism in Enzyme ProductionEnzyme Production酵母酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有14个圆形光亮的子囊孢子。啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。第50页/共102页第51页/共102页常见产酶微生物 Common microorganism in Common microorganism in

29、 Enzyme ProductionEnzyme Production酵母酵母假丝酵母假丝酵母(CandidaCandida)假假丝丝酵酵母母的的细细胞胞圆圆形形，卵卵形形或或长长形形。无无性性繁繁殖殖为为多多边边芽芽殖殖，形形成成假假菌菌丝丝，也也有有真真菌菌丝丝，可可生生成成无无节节孢孢子子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落呈乳白色或奶油色。假假丝丝酵酵母母可可以以用用于于生生产产脂脂肪肪酶酶、尿尿酸酸酶酶、尿尿囊囊素素酶酶、转转化化酶酶、醇醇脱脱氢氢酶酶等等。具具有有较较强强

30、的的17-17-羟羟基基化化酶酶，可可以以用于甾体转化。用于甾体转化。第52页/共102页第53页/共102页发酵工艺条件及其控制 微生物发酵产酶的一般工艺流程微生物发酵产酶的一般工艺流程 细胞扩大培养养保藏细胞细胞活化发酵 分离纯化酶固定化细胞原生质体 固定化原生质体培养基预培养无菌空气第54页/共102页2.3 酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production1、培养基2、发酵条件及控制3、提高产酶的措施GoGoGo下一节本章目录第55页/共102页五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子

31、、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（mediummedium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素第56页/共102页构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制第57页

32、/共102页构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。氮源无机盐需要注意合适的碳氮比第58页/共102页生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常

33、用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 第59页/共102页培养基各种生物对营养的需求第60页/共102页1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则第61页/共102页实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基

34、或LBLB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；第62页/共102页枯草杆菌BF7658-BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。枯草杆菌AS1.398AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。地衣芽孢杆菌270927

35、09碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。黑曲霉AS 3.350AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH 5.5)。游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH 7.2)。桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。黑曲霉AS3.396AS3.396果胶酶发酵培养基:麸皮5%,果

36、胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。枯草杆菌AS1.398AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制)回本节第63页/共102页2 2、发酵条件及控制pHpH值的调节控制值的调节控制 温度的调节控制温度的调节控制 溶解氧的调节控制溶解氧的调节控制 第64页/共102页发酵条件及控制pHpH值的调节控制值的调节控制不同的细胞，其生长繁殖的最适

37、不同的细胞，其生长繁殖的最适pHpH值有所不同。一般细菌和放值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适线菌的生长最适pHpH值在中性或碱性范围（值在中性或碱性范围（pH6.5pH6.58.08.0）；霉菌）；霉菌和酵母的最适生长和酵母的最适生长pHpH值为偏酸性值为偏酸性(pH4(pH46)6)；植物细胞生长的最；植物细胞生长的最适适pHpH值为值为5 56 6。第65页/共102页发酵条件及控制pHpH值的调节控制值的调节控制细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值与生长最适值与生长最适pHpH值往往有所不同。细胞生产某种酶值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适的最适pHpH值通常接近于该酶

38、催化反应的最适值通常接近于该酶催化反应的最适pHpH值。值。有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pHpH值，值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶往往可以改变各种酶之间的产量比例。例如，采用米曲霉发酵生产蛋白酶时，当培养基的时，当培养基的pHpH值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的值为碱性时，主要生产碱性蛋白酶；培养基的pHpH值为中值为中性时，性时，主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶主要生产中性蛋白酶；而在酸性的条件下，则以生产酸性蛋白酶为主。为主。第6

39、6页/共102页发酵条件及控制pHpH值的调节控制值的调节控制培养基的培养基的pHpH值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。值与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pHpH值向酸性方向移动；值向酸性方向移动；含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pHpH值向碱性方向移动；值向碱性方向移动；以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pHp

40、H值降低；值降低；以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pHpH值上升，然值上升，然后又随着氨被细胞同化而使后又随着氨被细胞同化而使pHpH值下降；值下降；第67页/共102页发酵条件及控制pHpH值的调节控制值的调节控制磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基的pH值向酸性方向移动。第68页/共102页发酵条件及控制发酵过程中，对培养基pH值进行适当的控制和调节方法:调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定pH值；或者在必要时通过流加适宜的

41、酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。第69页/共102页第70页/共102页发酵条件及控制温度的调节控制温度的调节控制不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的不同的细胞有不同的最适生长温度。例如，枯草杆菌的最适生长温度为最适生长温度为34343737，黑曲霉的最适生长温度为，黑曲霉的最适生长温度为282832 32 等。等。第71页/共102页通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于

42、在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。第72页/共102页发酵条件及控制温度的调节控制温度的调节控制温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设进行温度的调节控制，在发酵罐或其他生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。管等，并且随时备有冷水和热水，以满足温度调控的需要。第73页/

43、共102页发酵条件及控制溶解氧的调节控制 细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质（一般是指各种碳源）经过有氧降解而生成大量的细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量ATP。第74页/共102页溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大

44、。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。回本节第75页/共102页发酵条件及控制溶解氧的调节控制调节通气量调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质 控制溶解氧方法第76页/共102页发酵条件及控制溶解氧的调节控制调节气液接触面积的措施调节气液接触面积的措施:为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。为了增大气液两相接触面积，应是通过培养液的空气尽量分散成小气泡。在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，在发酵容器的底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液中，是增加气液接触面积的主要方法。是

45、增加气液接触面积的主要方法。装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效装设搅拌装置或增设挡板等可以使气泡进一步打碎和分散，也可以有效地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。地增加气液接触面积，从而提高溶氧速率。第77页/共102页发酵条件及控制溶解氧的调节控制改变培养液的性质：可以通过改变培养液的组分或浓度等方法，有效地降低培养液的黏度；设置消泡装置或添加适当的消泡剂，可以减少或消除泡沫的影响，以提高溶氧速率。第78页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物添加诱导物控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度 添加表面活性剂添加表面活性剂 添加产酶促进剂添加

46、产酶促进剂 第79页/共102页提高酶产量的措施 添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物 酶的催化反应产物 作用底物的类似物第80页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物添加诱导物1.1.酶的作用底物酶的作用底物许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆菌许多诱导酶都可以由其作用底物诱导产生。例如，乳糖诱导大肠杆菌-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。L-L-苯丙氨酸诱导苯

47、丙氨酸解氨酶的合成等苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶的合成等第81页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物添加诱导物2.2.酶的反应产物酶的反应产物有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化有些酶可以由其催化反应产物诱导产生。例如，半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成；纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。诱导纤维素酶的生物合成；没食子酸诱导单宁酶的产生等。第82页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的提高酶产量的措施措施添

48、加诱导物添加诱导物第83页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物添加诱导物第84页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加诱导物添加诱导物酶作用底物的类似物有些酶的最有效的诱导物是可以与酶结合，但不能被酶催化的底物类似物。例如，异丙基-硫代半乳糖苷（IPTG）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍；第85页/共102页控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容

49、易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。第86页/共102页添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（TweenTween）、曲通(Triton)(Triton)等添加到培养基

50、中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。回本节第87页/共102页第88页/共102页添加表面活性剂第89页/共102页发酵条件及控制提高酶产量的措施提高酶产量的措施添加产酶促进剂添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。在酶的发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。发酵生产过程中，添加适宜的产酶促进剂，往往可以显著提高酶的产量。例如，