细菌和病毒遗传分析.pptx

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1、1 内内 容容细菌和病毒的特点细菌的遗传分析噬菌体的遗传分析第1页/共89页2第一节 细菌和病毒的特点第2页/共89页31.1 细菌的特点及培养技术 细菌特点 单细胞生物，不同细菌大小不一，1-2um长，宽 结构：鞭毛、荚膜、细胞壁、胞膜、胞质、DNA（称为拟核）遗传物质：1个 主染色体、多个微小染色体 微小染色体：也称为质粒，携带不同的基因，使细菌具有不同的性状；被作为基因工程的载体第3页/共89页4 细菌特点 繁殖世代短（20分钟一个世代）会发生突变：菌落形态性状的突变：菌落的形状、颜色和大小等。生理特性的突变：丧失合成某种营养物质能力的营养缺陷型（营养缺陷型）。抗性突变包括：抗药性或抗感

2、染性。1.1 细菌的特点及培养技术第4页/共89页5第5页/共89页61.1 细菌的特点及培养技术细菌的培养技术 固体和液体培养：液体培养后，细菌分裂呈几何级数增殖 吸取少量液体，无菌环境下，涂布在固体培养基上 细胞在固体培养基上不能移动，每个细胞会聚集成群，达107个细胞，肉眼可见（平板培养），称为无性繁殖/克隆第6页/共89页71.1 细菌的特点及培养技术细菌突变研究方法 1952年发明的影印培养法 过程：母板上长成菌落，然后拿一个比培养皿小的木板，上面包裹灭菌的丝绒，印在母板上，菌落会吸附在丝绒上，然后把丝绒印到不同成分的培养基上。结果判断：凡是不能够在新的培养基上的菌落，为缺陷菌落。第

3、7页/共89页8细菌的固体、稀释培养及菌落细菌的固体、稀释培养及菌落第8页/共89页9 合成代谢功能突变型合成代谢功能突变型:营养缺陷型（营养缺陷型（auxotroph)auxotroph)野生型（野生型（wild type)wild type)缺陷型（缺陷型（deficient)deficient)原养型（原养型（prototroph)prototroph)MetMet-甲硫氨基酸缺陷型甲硫氨基酸缺陷型 MetMet+Thi-Thi-硫胺缺陷型硫胺缺陷型 Thi+Thi+Pur-Pur-嘌呤缺陷型嘌呤缺陷型 Pur+Pur+分解代谢功能突变型：分解代谢功能突变型：lac-lac-乳糖突变型，

4、野生型为乳糖突变型，野生型为lac+lac+抗性突变型：抗性突变型：抗药性或抗感染性抗药性或抗感染性StrStrR R,StrStrS S 分别表示对链霉素有抗性和敏感分别表示对链霉素有抗性和敏感T1T1R R,T1,T1S S分别表示对分别表示对T1T1噬菌体有抗性和敏感噬菌体有抗性和敏感 R R：resistantresistant；S S：sensitivesensitive细菌的突变型和标识细菌的突变型和标识第9页/共89页10细菌的突变型和标识细菌的突变型和标识基本培养基（minimal medium）仅含葡萄糖和无机盐。完全培养基（complete medium）含细菌所必需的各种

5、营养成分。第10页/共89页111.2 病毒的生物学特征比细菌结构更为简单，只有一条染色体（DNA或 RNA）。病毒结构：蛋白质外壳+包被的核酸所组成的颗粒。种类：根据宿主(动物、植物、细菌)或遗传物质(DNA或RNA)来分类。感染细菌的病毒(Bacterial phage)，称为噬菌体(phage)，是目前经过广泛研究，了解比较清楚的一种病毒。在没有宿主情况下，可以视之为没有生命/或者一堆化合物第11页/共89页121.2 病毒的生物学特征病毒种类 依遗传物质划分：单链DNA，单链RNA，双链DNA，双链RNA 依与宿主细胞关系划分：如烈性噬菌体；温和噬菌体第12页/共89页13噬菌体第13

6、页/共89页14细菌和病毒在遗传研究中的优越性繁殖世代周期短：min/h易于操作管理和进行化学分析(纯培养与代谢产物累积)，节省空间和人力、物力；便于研究基因的突变(表现与选择)；便于研究基因作用(突变型生长条件与基因作用)；便于研究基因重组(重组群体大、选择方法简便有效)；遗传物质简单，可作为研究高等生物的简单模型第14页/共89页151.4 细菌和病毒的拟有性过程 细菌和病毒不同于真核生物配子融合的有性过程 遗传物质传递：从一个细胞传到另一个细胞细菌的拟有性过程：转化、接合、性导、转导第15页/共89页16第二节 细菌的遗传分析第16页/共89页171 细菌转化转化：细菌通过细胞膜摄取周围

7、供体DNA的片段，并可能将外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。+第17页/共89页181 细菌转化转化：细菌通过细胞膜摄取周围供体DNA的片段，并可能将外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。+第18页/共89页191 细菌转化外源DNA 要求：双链DNA（环状质粒）；环状/线性 细菌要求：处于感受态状态，可能只发生在细菌生长周期的某一时期 第19页/共89页201 细菌转化转化的类型 自然转化（natural transformation）：细菌能够自然地吸收DNA，如枯草杆菌的转化。工程转化（engineered transformation）通过某种处理使细菌能够摄入

8、外源DNA，如大肠杆菌 的转化:电转化、化学法转化（氯化钙法）。转化效率：约1 转化片段的长度：800 bp-20 kb第20页/共89页21电转仪和电转杯（仍需是感受态细胞）1 细菌转化第21页/共89页22转化 转化进宿主细胞的质粒数目在宿主菌中不等。分为：松弛型质粒（几十至几百个拷贝）严谨型质粒（10个拷贝以下）1 细菌转化第22页/共89页23转化的质粒丢失情况 吖黄素处理细胞，不妨碍细菌增殖，有选择性阻碍质粒复制，在细胞中丢失。（有压力才有动力）无选择压力1 细菌转化第23页/共89页241 细菌转化转化过程结合：供体DNA与受体位点的结合 双链DNA结合在细胞表面几个受体位点穿入：

9、供体DNA由双链DNA 变成单链DNA外切酶降解其中一条链，产生能量，把另外一条单链拉近细胞第24页/共89页251 细菌转化转化过程 联会：受体DNA双链部分变为单链，与供体单链DNA互补配对 整合：单链供体DNA与受体DNA对应位点置换，稳定渗入到受体DNA中，随着受体DNA复制而复制第25页/共89页261 细菌转化转化成功的前提获知受体DNA的序列 供体DNA含有相应的序列，可与受体DNA互补配对第26页/共89页271 细菌转化质粒的转化 过程比较简单。可以以游离状态存在，不一定发生整合第27页/共89页282 细菌接合第28页/共89页292 细菌接合接合：遗传物质从供体（雄性）转

10、移到受体（雌性）的过程第29页/共89页302.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现A菌:met-bio-thr+leu+thi+；需要在基本培养基上补充甲硫氨酸和生物素才能生长；B菌：met+bio+thr-leu-thi-；需要在基本培养基上补充苏氨酸、亮氨酸和硫胺才能生长；Lederberg和Tatun细菌杂交实验（1946）第30页/共89页312.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现A B完全液体培养基完全液体培养基基本固体培养基基本固体培养基met-bio-thr+leu+thi+met+bio+thr-leu-thi-基本固体培养基（不含有上述基本固体培养基（不含有上述5

11、种物质）种物质）Lederberg和Tatun细菌杂交实验（1946）？第31页/共89页322.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现A菌B菌过滤器bio-bio+结果表明：结果表明：A A和和B B菌即使在完全菌即使在完全培养液中生长一培养液中生长一段时间，但如果段时间，但如果不发生两者之间不发生两者之间的接触，仍然不的接触，仍然不能在基本培养基能在基本培养基上生长。上生长。（细菌（细菌不能通过滤片，不能通过滤片，DNADNA可以通过）可以通过）戴维斯U型管试验，1950第32页/共89页332.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现综合两个实验得出结论：A和B细菌通过接触，发生了杂交

12、，遗传物质发生了交换，产生了与两个亲代菌株不同的野生型met+bio+thr+leu+thi+菌株。A菌和B菌怎么接触的呢第33页/共89页342.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现F-F+性伞毛：F+细菌表面的细长纤毛两株的接合电镜照片第34页/共89页352.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现Lederberg和Tatun细菌杂交实验（1946）结果猜想？A 菌 B菌第35页/共89页362.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现Lederberg和Tatun细菌杂交实验（1946）结果猜想？A 菌 B菌第36页/共89页372.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现A 菌

13、 B菌（链霉素处理，阻碍细菌分裂，能够转移基因；即B菌被链霉素杀死了，失去了繁殖能力，但其DNA还在）基本培养基B菌的基因没有转移到A菌第37页/共89页382.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现A 菌 B菌基本培养基A菌的基因转移到B菌（链霉素处理，阻碍细菌分裂，能够转移基因；即A菌被链霉素杀死了，失去了繁殖能力，但其DNA还在）第38页/共89页392.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现上述现象的原因 A菌受处理不能分裂，但能够转移基因（DNA）B菌未受处理能分裂，在分裂过程中接受A转移过来的基因(DNA)基因间单向发生了交换，最终形成野生型菌落 A菌可以看做供体（雄），B菌可

14、以看做受体（雌）A菌向B菌转移的到底是什么物质？第39页/共89页402.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现F因子：细菌间被转移物质称为F因子，又被称为质粒、性因子、致育因子。A菌可以看作供体（雄），记为F+，含有F因子；B菌可以看作受体（雌），不含F因子，记为F-。第40页/共89页412.1 2.1 接合现象的发现接合现象的发现F因子的转移引起细菌间杂交 F因子的化学本质是DNA，以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上。F因子第41页/共89页42大肠杆菌F因子向F-细胞转移图解第42页/共89页432.2 高频重组与中断杂交技术F+F-F+(几乎所有)Hfr：high fr

15、equency of recombinationA BF+F-较少F+，较多重组子A B第43页/共89页442.2 高频重组与中断杂交技术1951年，卡瓦里（Cavalli）等人，1954年海斯（Hayes）先后在A菌株中分离出新的菌株。Hfr形成 F因子可以整合到细菌环状DNA上（染色体上），含有重组状态的这种F菌株叫Hfr（高频重组）菌。特点 (1)可以作为供体，与B杂交，重组频率比AB高1000倍，称高频重组菌株。(2)转移F因子频率低第44页/共89页45F因子的存在状态2.2 高频重组与中断杂交技术高频重组与中断杂交技术第45页/共89页462.2 高频重组与中断杂交技术Hfr怎么

16、进行基因的重组？中断杂交技术揭示了上述现象。中断杂交：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。重组的顺序是什么呢？第46页/共89页472.2 高频重组与中断杂交技术 苏AA 亮AA 叠氮化钠 噬菌体 乳糖 半乳糖 链霉素F+thr+leu+azir tonr lac+gal+strsF-：thr-leu-azis tons lac-gal-strr 将 F+与F-同时加入装有完全培养基的大试管中，一定时间取样振荡，稀释接种至添加str但不含thrAA和leuAA的培养基上，形成含有F-和F+的重组子，再把菌落分别转移到只添加azi、ton、以lac或gal为炭源的选择性培养基上

17、。第47页/共89页482.2 高频重组与中断杂交技术F+F-混合后震荡培养（形成结合管）添加str，无thrAA和leuAAthr+，leu+，strr（首先确定F+和F-的重组子具有F+的thr+、leu+和F-的strr）(1)混合(2)涂平板那么F+菌其他基因是否也得到重组？重组顺序呢？第48页/共89页492.2 高频重组与中断杂交技术9min11min18min25minazi ton tac galazi ton lac galazi ton lac galazi ton lac galF+F-上述表明：Hfr菌株所携带的thr+、strr、leu+、azir、tonr、lac+

18、和gal+遗传信息已经被重组进F-；但是，为什么在不同的时间取样会出现不同的结果？（3）注：时间为F+和F-混合的时间，如9混合9min后中断，混合11min后中断第49页/共89页502.2 高频重组与中断杂交技术Hfr进入F-的频率：从重组子的出现，随时间的推移，菌落开始增加，直至某一百分数，出现时间越早，百分数越高。（1 1）F+F+的基因按一定顺序和时间间隔进入F F-（2 2）每个基因进入F F-有一定频率，且在短时间内达到最高（3 3）进入F F-越早，频率越高（4 4）F F因子进入迟，频率低第50页/共89页512.2 高频重组与中断杂交技术一个特定的Hfr菌株和F-菌株接合时

19、首先出现的F-细胞中供体性状是固定不变的 而且各性状的出现有一定的先后次序 说明供体染色体是从某一特定位置即原点开始逐渐转移的 标记基因离原点越远，进入F-细胞越迟。不同的Hfr菌株的染色体原点不同，转移方向也不同。第51页/共89页522.2 高频重组与中断杂交技术根据重组子出现时间，得到Hfr基因在F-的连锁图，距离单位为min，不反应基因间的物理距离。中断杂交技术得到的基因连锁图ton在azi进入F-后2min后才进入F-，可以认为azi和ton相隔2个单位。O azi ton lac gal 0 9 11 18 25第52页/共89页532.2 高频重组与中断杂交技术用不同Hfr菌株进

20、行中断杂交试验，基因转移的顺序，转移起点和转移方向很不相同。大肠杆菌环状染色体第53页/共89页542.3 F因子整合到细菌染色体的过程细菌染色体 Hfr染色体附加体：可以整合到染色体上成为染色体一部分的质粒。第54页/共89页552.3 F因子整合到细菌染色体的过程F因子：质粒的一种。组成部分：转移的原点；形成性伞毛基因群；DNA复制酶基因；插入序列（具有极性，决定了插入转移的方向）第55页/共89页562.3 F因子整合到细菌染色体的过程供体受体第56页/共89页572.3 F因子整合到细菌染色体的过程细菌基因重组特点：单交换导致不平衡部分二倍体线性染色体只有偶数交换才能产生平衡的重组子相

21、反重组子不出现第57页/共89页582.3 F因子整合到细菌染色体的过程当两基因转移时间接近2min时，中断杂交技术测定基因距离不可靠，需要重组作图。重组作图是一种传统的作图方法。第58页/共89页592.3 重组作图（当基因转移时间接近2min时）Hfr F-lac+ade+strs lac-ade-strr完全培养基，添加str，无adeade+strr（lac需进一步确定）EMB培养基，伊红美兰培养基，含乳糖lac-ade+（基因发生交换,浅红色菌落）lac+ade+（基因未发生交换，暗红色菌落lac和ade基因重组率（或距离）（lac+ade+）+（lac-ade+）（lac-ade+

22、）100%100%lac+（乳糖发酵）和ade-（腺嘌呤缺陷型）基因紧密连锁当含有lac+时，lac+基因表达产生lac酶，分解乳糖，产酸，菌落为深紫色；否则为浅红色第59页/共89页60 2.3 重组作图重组后F-染色体重组后F-染色体第60页/共89页612.3 重组作图（lac+ade+）+（lac-ade+）（lac-ade+）100%100%lac和ade基因重组率（或距离）1min相当于20%的重组率第61页/共89页623 性导第62页/共89页633 性导利用F因子进行细菌基因的转移叫做性导。F ：既可以整合到细菌染色体上，又可以从整合的细菌染色体随染色体片段上解离下来的F因子

23、。F 因子组成：F因子+受体染色体片段第63页/共89页64小结细菌的遗传一般指质粒在供体与受体之间的转移接合和性导是转移的方式，转化也是接合的一种方式转移的物质分为：F因子、性因子、致育因子和F因子接合转移的物质是F因子，性导转移的物质是F因子F 因子=F因子+受体染色体片段第64页/共89页65小结含有质粒的菌株称为F+菌株，不含有质粒的称为F-菌株；F+菌株的质粒易与受体染色体发成重组的称为Hfr菌株附加体是指可以整合到染色体上成为染色体一部分的质粒F+、F-、Hfr、F 各自关系第65页/共89页66第三节 噬菌体的遗传分析n烈性噬菌体n烈性噬菌体基因重组n溶原性噬菌体n噬菌体转导第6

24、6页/共89页67尾管刺突由头部、颈部、尾部组成第67页/共89页68噬菌体的特点个体极小：个体极小：2-200kb，DNA或者或者RNA，只能借助电镜才，只能借助电镜才可看见，实验时一般用肉眼观察它感染细菌后所形成的可看见，实验时一般用肉眼观察它感染细菌后所形成的噬菌斑加以识别。噬菌斑加以识别。专性寄生：在活体外不具任何生命特征，往往一个噬菌专性寄生：在活体外不具任何生命特征，往往一个噬菌体只感染一种细菌。侵染过程：体只感染一种细菌。侵染过程：吸附吸附 遗传物质注入遗传物质注入 复制复制 裂解细菌裂解细菌无细胞结构：化学组成和繁殖方式简单。不同结构的噬菌体（或不同的突变型）可同时感染一个细菌

25、，并能在细菌细胞内进行基因重组，即混合感染。第68页/共89页691 烈性噬菌体定义：当噬菌体感染细菌后，寄主细胞的DNA立即停止活动，由噬菌体的DNA指导合成噬菌体的DNA和蛋白质，产生新的子噬菌体，最后寄主细菌裂解，释放出成熟的子噬菌体，这一类噬菌体称之为烈性噬菌体。通过它对相邻细菌连续不断地侵染和裂解，在长满细菌的不透明的菌落上看到一个圆形的透明区噬菌斑。第69页/共89页70噬菌斑描述：大小，透明与不透明，边缘光滑与清晰。第70页/共89页711 烈性噬菌体烈性噬菌体生活史第71页/共89页722 烈性噬菌体基因重组烈性噬菌体性状烈性噬菌体性状噬菌斑透明程度噬菌斑透明程度噬菌斑大小噬菌

26、斑大小描述描述半透明半透明透明透明小小大大基因基因h+hr+r第72页/共89页732 烈性噬菌体基因重组E.coli B(亲本1)(亲本2)两个噬菌体可以通过感染同一宿主菌实现两者之间重组。第73页/共89页742 烈性噬菌体基因重组E.coli B(亲本1)(亲本2)形成噬菌斑统计各种噬菌斑的数目（亲本、重组型）计算重组率同时感染1种细菌第74页/共89页75重组率hrh r100总噬菌斑数 2 烈性噬菌体基因重组表型推导基因型透明，小hr（亲本）半透明，大hr（亲本）半透明，小hr透明，大hr第75页/共89页763 温和噬菌体与溶原性细菌温和噬菌体两种增殖周期：溶菌周期和溶原周期12第

27、76页/共89页773 温和噬菌体和溶原性细菌定义：温和噬菌体：感染细菌后，并不使细菌出现出现溶菌现象的噬菌体。溶原性：细菌本身带有噬菌体，但不立即导致溶菌的现象。溶原性细菌：被温和噬菌体感染但并不发生溶菌现象的细菌。原噬菌体：细胞内含有的无感染能力的的噬菌体。第77页/共89页783 温和噬菌体和溶原性细菌溶原菌中原噬菌体的存在形式：游离在细胞质中，增殖与细菌染色体不同步整合到细菌染色体中原噬菌体的存在形式原噬菌体的存在形式第78页/共89页794 转导（噬菌体应用）定义指以噬菌体为媒介，将细菌小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一个细菌的过程。（这一过程类似F因子的形成性导。）转导种类普遍

28、性转导：转导片段为细菌染色体较多部分特异性（局限性）转导：转导细菌染色体特定部分。第79页/共89页804 转导（普遍性转导的发现）普遍性转导的频率较低,约为10-5,两个基因同时转导的频率则更低,仅有10-5 10-5=10-10第80页/共89页81判断细菌基因间的位置关系（连锁关系）以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu、thr、azi三个基因的顺序。供体 thr+leu+azir 受体thr-leu-azis，观察其共转导率。三个基因间的排列顺序4 转导（噬菌体应用）第81页/共89页82 重组值的计算 a+b+供体 ab受体第82页/共89页834 转导特异性转导噬菌体只能

29、转移细菌染色体的特定部分和基因第83页/共89页844 转导（特异性噬菌体）整合进供体细整合进供体细胞，形成原噬胞，形成原噬菌体状态菌体状态缺陷噬菌体缺陷噬菌体缺陷噬菌体整合缺陷噬菌体整合进受体细胞进受体细胞受体细胞通过受体细胞通过噬菌体获得供噬菌体获得供体细胞体细胞gal基因基因第84页/共89页85特异性转导原理特异性转导原理噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分和基因.如如 噬菌体是一种附加体噬菌体是一种附加体(episome),(episome),即可作为一个复制即可作为一个复制因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点因子独立存在，又可以整合到细菌染色体上的特定位点attBattB位点位点,而形成原噬菌体。而形成原噬菌体。4 转导第85页/共89页86局限性转导的特点局限性转导的特点 受包装容量限制，局限性转导形成的噬菌体颗粒往往是缺失体(defective)。供体基因不是置换受体基因，而是插入attB位点，因此使宿主体内带有两个拷贝的转导基因。4 转导第86页/共89页87小结小结温和噬菌体、烈性噬菌体、原噬菌体、溶菌周期、溶原周期转导(普遍性转导、局限性转导)区别第87页/共89页88The End第88页/共89页89感谢您的观看！第89页/共89页