微生物培养技术.pptx

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1、微生物微生物非细胞生物：病毒原核生物：细菌、放线菌、支原体、立克次氏体真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）第1页/共45页菌落：菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。第2页/共45页细菌的营养类型 根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。自养型自养型:异养型异养型:腐生菌腐生菌 寄生菌寄生菌 光合自养型

2、:光合细菌化能自养型:硝化细菌第3页/共45页一、微生物的分离和纯培养（3 3项技术1 1个案例）（一）培养基配制技术（二）无菌技术（三）接种技术 案例：大肠杆菌的分离和纯培养 第4页/共45页1 1、培养基定义：（课本第2 2页）2 2、营养构成：环境条件：环境条件：pHpH、氧气、二氧化碳、渗透压等、氧气、二氧化碳、渗透压等 （一）培养基配制技术营养成分：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子第5页/共45页固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等半固体培养基可观察微生物的运动液体培养基常用于发酵工业。（1 1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。3.3.培养基的分类第6页/共45页固

3、体培养基固体培养基平板培养基（课本第2页）斜面培养基固体培养基中需加入凝固剂，如琼脂第7页/共45页半固体培养基半固体培养基无运动无运动 有运动有运动 半固体培养基中也需要加入凝固剂琼脂，但加入量少于固体培养基。第8页/共45页液体培养基液体培养基表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长第9页/共45页选择培养基（2 2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基加入青霉素的培养基:抑制细菌和放线菌的生长，分离酵母菌、霉菌等真菌。不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌定义（课本第7页）举例：加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌第10页/共45页鉴别培养基 根据微生物的代谢特点，在培养基中

4、加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同种类的微生物。例如：在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来 鉴别大肠杆菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝 结合，使菌落呈蓝紫色，并带有金属光泽。(课本1515页)第11页/共45页 用化学成分已知的化学物质配成的，因成分明确，常用于分类、鉴定等 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。合成培养基:天然培养基：（3 3）按成分分：合成培养基和天然培养基 用化学成分不明确的天然物质配成的，如血清、组织提取液等第12页/共45页称量：准确地称取各种成分。牛肉膏比较黏稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛 肉膏和

5、蛋白胨都容易吸潮，称量时动作要 迅速，称后要及时盖上瓶盖。4.4.培养基的配制步骤（第8 8页）（1 1）.计算:根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的 比例，计算配制100mL100mL的培养基 时，各种成分的用量。（参考课本8383页培养基配方）（以牛肉膏蛋白胨固体培养基为例）第13页/共45页（2 2）.溶化：加水加热熔化牛肉膏 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯加入少量的 水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分 离后，用玻棒 取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解；加入琼脂；用蒸馏水定容到100mL100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。（3 3）.调节

6、pHpH（4 4）.分装、包扎（5 5）.灭菌（6 6）倒平板第14页/共45页待培养基冷却到50 50 左右时，在酒精灯附近倒平板。倒平板在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培 养皿，立刻盖上皿盖。待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。第15页/共45页倒平板技术倒平板技术倒平板技术倒平板技术第16页/共45页（二）无菌技术 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。、消毒（1 1）定义：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物（不 包括芽孢和孢子）第17页/共

7、45页A A、煮沸消毒法:100:100煮沸5-6min5-6minB B、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮30min30min 或 80 80 下煮15min15minC C、化学药剂消毒法:用酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源D D、射线消毒法（2 2）消毒的方法：第18页/共45页（1 1）定义：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子 。2 2、灭菌（2 2）灭菌的方法：A A、灼烧灭菌第19页/共45页C、高压蒸汽灭菌：100kPa、121 下维持 15-30min.B、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。第20页/共45页（三）接种技术（课本第2 2页

8、）1.1.定义2.2.平板培养基上接种方法平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法 平板划线的操作方法连续划线法交叉划线法第21页/共45页第22页/共45页稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。第23页/共45页第24页/共45页第25页/共45页1、微生物实验室培养的基本操作程序（1 1）器具的灭菌 （2 2）培养基的配制（3 3）培养基的灭菌 （4 4）倒平板（5 5）微生物接种

9、（6 6）恒温箱中培养（7 7）菌种的保存（四）案例：大肠杆菌的分离和纯培养第26页/共45页 （1）制备牛肉膏蛋白胨培养基2 2、大肠杆菌的分离和纯培养步骤第27页/共45页（2)2)配制培养基：计算称量；熔化；调PHPH；分装；灭菌；倒平板 （3 3）接种：平板划线法；稀释涂布平板法。（4 4）培养：倒置，3737恒温箱，1212和24h24h。（5 5）纯化培养：倒置，3737恒温箱，24h24h。（6 6）菌种保藏：临时、长期保存法。第28页/共45页菌种的保存 1 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于44冰箱保存。2 2、长期保存：甘油冷冻管藏法-20-20 冷冻箱保存

10、第29页/共45页二、培养基对微生物的选择作用第30页/共45页（一）、基础知识1 1、纤维素与纤维素酶【案例】分解纤维素的微生物的分离纤维素是一种多糖纤维素酶是一种复合酶纤维素纤维二糖葡萄糖C C1 1酶、CxCx酶葡萄糖苷酶第31页/共45页（二）、筛选1 1、方法：刚果红染色法原理：刚果红（CRCR）可以与纤维素形成红 色复合物，当纤维素被纤维素酶分 解后，红色复合物无法形成，出现 以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛 选纤维素分解菌。第32页/共45页常用的刚果红染色法有两种方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖1mg/mL1mg/mL的CR CR 溶液，1015m

11、in1015min后，倒去CRCR溶液，加入 1mol/L1mol/L的NaClNaCl溶液，15min15min后倒掉NaClNaCl溶液。方法二：配制质量浓度为10mg/mL10mg/mL的CRCR溶液，灭菌 后，按照每200mL200mL培养基加入1mL1mL的比例加入 CRCR溶液，混匀后倒平板。一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红第33页/共45页（1 1）土壤取样 （2 2）选择培养（可省略）（3 3）梯度稀释 （4 4）涂布培养 （5 5）挑选产生透明圈的菌落（6 6）微生物培养（纯培养）（三）、实验流程第34页/共45页三、测定微生物的数

12、量第35页/共45页（一）测定微生物数量的方法1.1.直接计数法最常用：显微镜直接计数法 （方法、优点、缺点、适用条件）一、基础知识第36页/共45页2 2、间接计数法：最常用的是稀释平板计数法稀释平板法稀释涂布平板法稀释混合平板法第37页/共45页（一）测定饮用水中大肠杆菌的数目配制培养基倒平板接种（滤膜法）培养观察记录二、实践案例第38页/共45页1 1、土壤取样（二）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数2 2、配制培养基尿素琼脂培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基第39页/共45页第40页/共45页3 3、样品稀释细菌：一般选用10104 4 、10105 5 、10106 6倍的稀释液进行培养放线

13、菌：一般选用10103 3 、10104 4 、10105 5倍的稀释液真菌：一般选用10102 2 、10103 3、10104 4倍的稀释液4 4、取样及平板接种（涂布平板或混合平板）第41页/共45页 在以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂，指示剂变红，就可以准确的鉴定该种细菌能够分解尿素。5 5、培养与观察：细菌：303037370 0C C的温度下培养1 12d2d；放线菌：252528280 0C C的温度下培养5 57d7d；霉菌：252528280 0C C的温度下培养3 34d4d。第42页/共45页 当菌落数目稳定时，选取菌落数在3030300300的平板进行计数。在同

14、一稀释度下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。每克样品中的菌数(C/V)M(C/V)MC:C:代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V:V:代表涂布平板时所用的稀释液的体积M M：稀释的倍数6 6、细菌计数第43页/共45页 菌落数的选择：一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时，则 以该平均菌落乘以稀释的倍数；若有两个稀释倍的平均菌落数均在3030300300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定：若比值小于2 2 应采取两者的平均数，若大于2 2，则取其中较小的菌 落总数。注意事项第44页/共45页感谢您的观看。第45页/共45页