血红蛋白提取和分离 .pptx

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1、思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不同蛋白质。第1页/共45页一、基础知识：一、基础知识：

2、凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）多孔的凝胶就叫分子筛）2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛的作用，来进行分离。胶的分子筛的作用，来进行分离。第2页/共45页3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内

3、部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第3页/共45页凝胶色谱法分离蛋白质的原理第4页/共45页凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第5页/共45页第6页/共45页 1、概念：在一定的范围内，能抵抗外

4、、概念：在一定的范围内，能抵抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液）的对溶液的（的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH值值第7页/共45页 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）

5、使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用比例在不同在不同PH范围内范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3第8页/共45页 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）料的科学研究（活性）（三）凝胶电泳法（三）凝胶电泳法电泳电泳带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电

6、场作用下发生迁移的过程。第9页/共45页 2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下下，这些基团会带上（，这些基团会带上（）。在。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）以及分子本身（）、（）、（）的）的不同使带电分子产生不不同使带电分子产生不同的（同的（），从而实现样品中各），从而实现样品中各种分子的分离。种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的电极所

7、带电荷相反的电极带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH第10页/共45页第11页/共45页分类：分类：P66琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳和和聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。测定（测定（）通）通常用十二烷基硫酸钠（常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量第12页/共45页电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第13页/共45页思考思考 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用人，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细

8、胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便，便于进行于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。提取血红蛋白。样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：二二 实验操作实验操作第14页/共45页1.样品样品血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链肽链共四

9、条肽链共四条肽链90n每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。第15页/共45页血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链

10、一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行D

11、NADNADNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。二、实验操作第16页/共45页第17页/共45页 二、实验操作(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。分离纯化。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作

12、：洗涤操作：1 1、采集血样。注意、采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血液凝固。2 2、低速短时间低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化的氯化钠钠溶液洗涤。溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复三次，直至上清、重复三次，直至上清液中已液中已没有黄色没有黄色，表明洗涤干净。，表明

13、洗涤干净。（一）样品处理（一）样品处理第18页/共45页红细胞的洗涤第19页/共45页(：2)2)2)2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的甲苯体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分分钟钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白。血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min2000r/m

14、in的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲苯层（层（最上层）：甲苯层（无色无色 透明透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白白 色薄层固体色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉层（最下层）：杂质沉 淀层（淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏

15、斗中静置片刻后，分出下层的斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。二、实验操作第20页/共45页分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）白色薄层固体（脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物第21页/共45页小结：样品处理1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分

16、层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。第22页/共45页（二）、血红蛋白的粗分离（二）、血红蛋白的粗分离-透析：透析：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，中，将透将透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。实验操作原理：透析袋能使小分子自由

17、进原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。出，而大分子保留在袋内。第23页/共45页透析过程动画演示透析过程动画演示第24页/共45页(三)纯化凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱第25页/共45页（二）凝胶色谱操作 （1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作

18、：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。第26页/共45页（2 2 2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意装

19、填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。第27页/共45页注意：注意：2 2、装填凝胶柱时不得气泡存在：、装填凝胶柱时不得气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果低分离效果1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙的空隙第28页/共45页 洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。注意：注意：1、液面不要低于凝胶表

20、面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。第29页/共45页装配好的凝胶柱第30页/共45页（3）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意

21、不要破坏凝胶面。凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液

22、，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。视频（6.30）第31页/共45页第32页/共45页3.样品的加入和洗脱第33页/共45页讨论：讨论：答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持范围内，维持结构和功能结构和功能注意：正确的加样操作注意：正确的加样操作1 1、不要触及破坏凝胶面、不要触及破坏凝胶面2 2、贴壁加样、贴壁加样

23、3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动1 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？液处理的目的是什么？第34页/共45页（三）纯度鉴定使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。第35页/共45页2 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液

24、。这使血红蛋白的分离过程非常直观，集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。大大简化了实验操作。第36页/共45页血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较然后通过凝胶色谱法将

25、相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定3 3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？第37页/共45页观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三 实验结果分析与评价第38页/共45页由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得

26、均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。第39页/共45页 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。第40页/共45页练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做质的研究和应用越来越深入，首先要做的

27、一步是的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质第41页/共45页2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白

28、质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较第42页/共45页3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固第43页/共45页5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数分子数或者或者CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页