理化检测食用菌粗蛋白杂质解析.pptx

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1、（1）滴定必须在沸腾条件下进行不能把锥形瓶从热源上取下来滴定可以加快还原糖与的反应速度；保持反应液沸腾可防止空气进入，避免次甲基蓝被氧化而增加耗糖量。（2）不能随意摇动锥形瓶 以免空气进入反应液中，使亚甲基蓝被氧化第1页/共57页项目三项目三 产品产品 理化指标检测理化指标检测模块六模块六 食用菌产品其他理化指标检测技术食用菌产品其他理化指标检测技术灰份灰份总糖总糖VC检测技术检测技术粗蛋白粗蛋白杂质杂质第2页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法 简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质）二甲苯二氯靛酚比色法 深色荧光法：准确度高，较复杂2，4-二硝基苯肼法还原型VC的测定

2、总VC的测定总VC=氧化型VC+还原型VC+二酮古乐糖酸少氧化+还原+二酮古乐糖酸操作复杂，结果易受影响氧化型+还原型第3页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法1、原理 VC的提取:用草酸/偏磷酸（不常用,需要在合适的PH下进行提取)将样品中的VC提取出来 用蓝色的碱性染料标准溶液(2,6二氯靛酚标准溶液),对提取液进行氧化还原滴定根据消耗的染料的量可计算出样品中还原型VC的含量终点指示原理:染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,2,6二氯靛酚碱性酸性蓝色红色第4页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂（1）2,6二

3、氯靛酚(2,6二氯靛酚吲哚酚钠盐)溶液 配制碳酸氢钠热蒸馏水溶解加2，6二氯靛酚溶解冷却后定容过滤保存备用棕色瓶低温滴定度的测定：每次使用均要进行该操作第5页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法2、试剂 1ml抗坏血酸标准溶液10ml浸提剂用2，6二氯靛酚溶液滴定呈粉红色15s不褪色取10ml浸提剂做空白试验（2%草酸OR2%偏磷酸）CV滴定度T(mg/ml)V1V2T每毫升2，6二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数C抗坏血酸的浓度,mg/mlV吸取抗坏血酸的体积,mV1滴定抗坏血酸溶液所用2，6二氯靛酚溶液的体积，mlV2滴定空白所用2，6二氯靛酚溶液的体积，ml。第6页/共

4、57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法2 2、试剂、试剂（2）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)u称取 100mg(准确至 0.1mg)抗坏血酸，溶于浸提剂中并稀至100mlu现配现用u试剂发黄，则弃去不用第7页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法3、实验步骤(VC的提取/滴定/空白滴定)取样品浸提剂捣成匀浆称取部分匀浆浸提剂定容到100ml过滤滤液有颜色用白陶土脱色0.4g/g样品取滤液10ml2,6二氯靛酚溶液滴定 自身为指示剂 浅红色酸式滴定管空白实验：浸提剂10ml第8页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法3、实验步骤(VV0)TA维生素C

5、(mg/100g)-100WV滴定样液时消耗染料溶液的体积，mlV0滴定空白时消耗染料溶液的体积，mlT2，6二氯靛酚染料滴定度，mg/mlA稀释倍数 定容体积/吸取体积W样品重量，g第9页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项（1）15秒钟红色不褪为终点样品中可能有其他杂质也能还原2，6-二氯靛酚，但一般杂质还原该染料的速度均较抗坏血酸慢（2）必须做空白实验第10页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项（3）样液制备时浆状物泡沫可能太多，可加数滴丁醇或辛醇（4）整个操作过程要迅速防止被VC氧化 滴定过程一般不超过2min 滴定所用的染料

6、应在1-4ml之间（微量滴定管）如果太多？太小？选择合适的滴定管滴定开始时，染料溶液要迅速加入，直至红色不立即消失,而后尽可能一滴一滴地加入（先快后慢）第11页/共57页VCVC检测技术检测技术2,6二氯靛酚滴定法4、注意事项（5）取样后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用（防止被氧化）1%草酸无此作用第12页/共57页VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法1、原理用定过量的 2,6二氯靛酚染料与试样中的维生素C进行氧化还原反应，多余的染料在酸性环境中呈红色用二甲苯萃取后比色，在一定范围内，吸光度与染料浓度呈线性相关，测剩余染料浓度，用差减法计算维生素 C含量。2、仪器

7、与试剂基本同二氯靛酚比色法/偏磷酸浸提第13页/共57页VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、实验步骤（1）样品处理 定容到100ml（同二氯靛酚比色法）（2）测定 30min内完成食用菌中杂质检测5ml2%偏磷酸和5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液6支试管/标准曲线（A500染料体积）5ml2%偏磷酸样品浸出液样品测定不同体积2,6二氯靛酚溶液10ml二甲苯用力摇动取有机层测A500用力摇动+5mlpH4.0的乙酸钠缓冲液+2ml染料溶液用力摇动第14页/共57页VC检测技术二甲苯二氯靛酚比色法2、实验步骤（3）计算 (2V)TA 维生素 C(mg/100g)100 W食用菌中杂质检测2所用2,6

8、二氯靛酚染料的体积，mlV查得2,6二氯靛酚溶液的体积，mlA稀释倍数T染料滴定度，mg/mlW样品重量，g第15页/共57页VC检测技术荧光法（氧化型VC+还原型VC）1、原理(1)偏磷酸提取样品中的VC(2)活性炭氧化提取液中的VC 还原型VC氧化型VC 样品中本来的氧化型VC 喹喔啉（具有荧光性）荧光强度与氧化型VC的浓度在一定条件下成正比食用菌中杂质检测+邻苯二胺（OPDA）第16页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂 （1）100g/ml抗坏血酸标准溶液 先用偏磷酸-乙酸溶解并定容配成1mg/ml测pH食用菌中杂质检测2.2偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释2.2偏磷酸-乙酸（

9、2）活性C（活化）活性C1mol/L盐酸加热回流1-2h第17页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）2、试剂食用菌中杂质检测过滤水洗烘箱中干燥洗到洗液中无Fe3+加入洗液蓝色检验：2%亚铁氯化钾+1%盐酸等量混合洗液中有Fe3+第18页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤（1）样品提取食用菌中杂质检测称取样品偏磷酸-乙酸溶液匀浆取适量匀浆含有1-2mgvc调酸碱度百里酚蓝指示剂显红色（2.8）偏磷酸-乙酸-硫酸定容到100ml过滤样品滤液(2)用活性C氧化第19页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤（2）氧化处理食用菌中杂质检测取样品滤液100ml活性

10、C过滤样品氧化液振摇1mi取抗坏血酸标准溶液100ml标准氧化液取滤液最初几ml舍去（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液第20页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤食用菌中杂质检测（3）制备试液（待测液）、标准液、空白液5ml标准氧化液5ml标准氧化液标准液标准空白液5ml样品氧化液5ml样品氧化液试液（待测液）试液空白液5ml硼酸-乙酸钠加水定容到25ml摇动15min5ml50%乙酸钠加水定容到100ml加水定容到25ml加水定容到100ml第21页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤食用菌中杂质检测（4）测荧光值标准液试液标准空白液试液空白液各2m

11、l5ml邻苯二胺避光放置35min测荧光值（荧光分光光度计）改为不同体积的标准液（0/0.5/1/1.5/2)标准曲线法样品荧光值标样荧光值样品空白荧光值标样空白荧光值第22页/共57页VC检测技术荧光法（GB第一法）3、实验步骤食用菌中杂质检测（5）计算样品中维生素C含量(mg/100g)=(IIb)c5D100(IsIsb)m100I样品荧光值；Ib样品空白溶液荧光值；Is标样荧光值；Isb标样空白溶液荧光值c标样质量浓度，0.1mg/mL（100g/ml）；m样品的质量，g。D样品(测荧光值时)稀释倍数；5-5ml标准氧化液100-样品滤液100ml第23页/共57页VC检测技术荧光法（

12、GB第一法）4、注意事项（1）尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C（2）不易过滤可改为抽滤或离心后取上清液过滤（3）活性炭用量应适当与准确（有吸附抗坏血酸的作用）（4）本法为外标法测定，也可通过标准曲线法测定（5）全部实验应避光操作（6）空白液中硼酸的加入消除产品中丙酮酸的干扰食用菌中杂质检测第24页/共57页VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）1、原理 样品中还原型VC经活性炭氧化为氧化型VC 原有的氧化型VC 脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。食用菌中杂质检测2，4-二硝基苯肼红色脎第25页/共57页VCV

13、C检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、实验步骤（1）样品提取 同前法（2）氧化取25ml 样品滤液2g活性C 振摇1min 过滤取滤液10ml 10ml2%硫脲溶液样品氧化液（3）呈色反应食用菌中杂质检测最初滤液舍去4ml氧化液4ml氧化液4ml氧化液空白平行实验2，4二硝基苯肼373h防止VC继续被氧化促进脎的形成氧化剂+脱色剂第26页/共57页VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、实验步骤食用菌中杂质检测冷却空白液室温样品液冰水冰水冷却2，4二硝基苯肼10-15min后（4 4）8

14、5%85%硫酸处理硫酸处理本步已成脎，但显色不稳定本步已成脎，但显色不稳定用浓硫酸处理，转变为用浓硫酸处理，转变为橘红色的双橘红色的双-2，4-二硝基苯二硝基苯每支+5ml85%硫酸边加边摇至少加1min室温下放置30min第27页/共57页VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、实验步骤食用菌中杂质检测（5 5）比色测定）比色测定 测测A A500500（6 6）绘制标准曲线）绘制标准曲线 50ml1mg/ml抗坏血酸标准溶液1g活性C 振摇1min 过滤取滤液10ml 5g硫脲 1%草酸定容到500ml（浓度为20g/ml）1%硫脲稀

15、释到不同浓度（1/2/4/6/10/12g/ml）以下操作同样品测定取4ml2，4二硝基苯肼373h5ml85%硫酸室温下放置30minA500标准曲线第28页/共57页VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）2、实验步骤食用菌中杂质检测（7 7）计算）计算X=（cV/m）F(100/1000)X样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；c由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，g/ml；m试样质量，g；F样品氧化处理时的稀释倍数；V呈色反应所用试样体积，ml。第29页/共57页VCVC检测技术检测技术2 2，4-4-二硝基苯肼

16、法二硝基苯肼法 （GBGB第二法）第二法）3、注意事项（1 1）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。（2）活性C氧化剂+脱色剂（深色样品）无色或已脱色样品溴或2，6二氯靛酚作氧化剂（3）硫脲的加入防止VC继续被氧化 促进脎的形成食用菌中杂质检测第30页/共57页食用菌中蛋白质检测测定蛋白质的方法可分为两大类测定蛋白质的方法可分为两大类利用蛋白质的共性利用蛋白质的共性，即含氮量（，即含氮量（16%16%）、肽键测定、肽键测定蛋白质含量蛋白质含量 ；利用蛋白质中特定利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量

17、。及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法具体测定方法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法、红外光谱蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法第31页/共57页食用菌中蛋白质检测凯氏定氮法凯氏定氮法测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数系数（1/16%1/16%）而求出蛋白质的含量而求出蛋白质的含量为为粗蛋白含量（含有少部分含粗蛋白含量（含有少部分含N N非蛋白核酸、非蛋白核酸、生物碱等）生物碱等）18331833年年KieldahlKieldahl首先提出首先提出常量常量K氏定氏定N法法

18、微量微量K氏定氏定N法法自动自动K氏定氏定N法法半微量半微量K氏定氏定N法、改良法等法、改良法等第32页/共57页食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理样品与浓硫酸和样品与浓硫酸和催化剂催化剂一同加热消化，使蛋白质分解一同加热消化，使蛋白质分解 碳和氢被氧化为碳和氢被氧化为COCO2 2和和H H2 2O O逸出逸出 有机氮转化为氨，与硫酸结合成有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵硫酸铵常量常量K氏定氏定N法法硫酸铜作催化剂常量、微量、半微量硫酸铜+二氧化钛改良2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 第33页/共57页食用菌中蛋白质检测1

19、1、原理、原理常量常量K氏定氏定N法法l加硫酸铜加硫酸铜催化剂指示消化终点：溶液为蓝绿色（硫酸铜溶液颜色），清澈透明l加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度蒸馏时碱性反应的指示剂（判断加碱量是否足够）C+CuSO4Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H20+SO2蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色（氢氧化铜沉淀、CUO沉淀、铜离子与氨的络合物），此时需再增加氢氧化钠用量。第34页/共57页食用菌中蛋白质检测常量常量K氏定氏定N法法2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+16H2O 消化l一定

20、是浓硫酸：一定是浓硫酸：浓硫酸具有脱水性浓硫酸具有脱水性使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性2H2SO4C2SO22H2OCO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫H2SO42NH3 (NH4)2SO4l加硫酸钾加硫酸钾增温剂，提高溶液沸点（330400）浓硫酸酸性浓硫酸酸性第35页/共57页食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理用硼酸吸收氨用硼酸吸收氨以标准以标准HClHCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。白质的含量。也可以用过量的标准也可以用过量的标准H H2 2SOSO4 4或标准或标准HClH

21、Cl溶液吸收后再溶液吸收后再以标准以标准NaOHNaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。常量常量K氏定氏定N法法整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定2NH3+4H3BO3 (NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B407+H2S04+5H20 (NH4)2SO4+4H2BO2 加碱蒸馏，使氨蒸出加碱蒸馏，使氨蒸出(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4第36页/共57页食用菌中蛋白质检测2 2、仪器与试剂、仪器与试剂（1）通风橱（2）消化装置（3）蒸馏装置（4）盐（硫）酸标准溶液配制、标定（5）奈氏试剂Nessler试 剂，K2（Hg

22、I4）常量常量K氏定氏定N法法3.5gKI+1.3gHgCl2溶于70毫升水。加30毫升4mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。溶解11.5gHgI2+KI10g于适量少许水，后加水稀释至50ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。第37页/共57页食用菌中蛋白质检测3 3、实验步骤、实验步骤（1）消化 常量常量K氏定氏定N法法5克样品+10克结晶硫酸钾+l克硫酸铜+浓硫酸25毫升小火加热保持和缓的沸腾使火力集中在凯氏瓶底部（以免溅附在壁上的蛋白质处于无硫酸存在的情况，使氮有损失。）液体为蓝蓝绿色透明绿色透明继续加热微沸1h冷却l样品放入定氮瓶内时

23、，不要沾附颈上.(用水冲洗)l消化时如不呈透明溶液，可放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。l消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下促进其消化完全第38页/共57页食用菌中蛋白质检测3 3、实验步骤、实验步骤（2）蒸馏、吸收常量常量K氏定氏定N法法B25毫升硼酸吸收液甲基红溴甲酚绿混合指示剂l下端插入液面下l40（可放在冷水浴中）A少量水、消化液、玻璃球C80毫升50%氢氧化钠溶液D加热蒸馏将全部氨蒸出:l估计时间1-2hl奈氏试剂检查是否蒸完lPH试纸检查冷凝管下端用水冲洗后继续蒸馏1min后关闭热源（防止倒吸）检验NH4+离子，遇铵根离子析出黄色

24、或红棕色沉淀第39页/共57页食用菌中蛋白质检测3 3、实验步骤、实验步骤（3）滴定常量常量K氏定氏定N法法馏出液标准盐酸溶液滴定甲基红溴甲酚绿混合指示剂蓝色微红色别忘记做空白实别忘记做空白实验！验！不称样不称样消化消化蒸馏蒸馏吸收吸收滴滴定定第40页/共57页食用菌中蛋白质检测3 3、实验步骤、实验步骤（4）计算常量常量K氏定氏定N法法C(V1-V)X0.014总氮()=X100WC盐酸标准溶液的摩尔浓度；V1样液滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；V空白滴定消耗的盐酸标准溶液的量(毫升)；W样品重量(克)；0.014氮的毫摩尔粗蛋白质()=总氮()KK换算系数，食用菌产品等于4.38第41

25、页/共57页食用菌中蛋白质检测4 4、注意事项、注意事项（1 1）样样品品放放入入定定氮氮瓶瓶内内时时，不不要要沾沾附附颈颈上上，万万一一沾沾附附可可用用少少量量水水冲冲下下，以以免免被被检检样样消消化化不不完完全全，结结果果偏低。偏低。（2 2）消消化化时时如如不不容容易易呈呈透透明明溶溶液液，可可将将定定氮氮瓶瓶放放冷冷后，慢慢加入后，慢慢加入30%30%过氧化氢过氧化氢2-3ml2-3ml，促使氧化。，促使氧化。（3 3）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷）消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其

26、消化完全。化完全。常量常量K氏定氏定N法法第42页/共57页食用菌中蛋白质检测（4 4）蒸馏装置不能漏气）蒸馏装置不能漏气（5 5）各种试剂及装置的作用及影响）各种试剂及装置的作用及影响浓浓H H2 2SOSO4 4 脱水炭化脱水炭化(生成生成CHN)CHN)、氧化、与、氧化、与NHNH3 3作用作用CuSOCuSO4 4 催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）催化剂、指示剂（消化、蒸馏前加碱）K K2 2SOSO4 4 提高沸点提高沸点有时加入硒粉、氧化汞有时加入硒粉、氧化汞催化剂（为了防止污染通常采用硫催化剂（为了防止污染通常采用硫酸铜）酸铜）50%NaOH50%NaOH的作用：释放铵盐中的的

27、作用：释放铵盐中的NHNH3 3。常量常量K氏定氏定N法法第43页/共57页食用菌中蛋白质检测K K氏烧瓶和取样量氏烧瓶和取样量1g1g以上的样品，以上的样品，K K氏烧瓶最小氏烧瓶最小500ml 500ml（加热均匀（加热均匀 缩短消化时间）缩短消化时间）H H2 2SOSO4 4和和K K2 2SOSO4 4的添加量的添加量 (一般指导原则一般指导原则)1g样品K2SO4：H2SO4=7g：12ml若取样量较大，如干试样5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。吸收液吸收液标准H2SO4溶液：用标准碱返滴定，甲醛(基)红指示剂硼酸：用HCl进行滴定，混合指示剂蒸馏蒸馏常量法常量法直接蒸馏直

28、接蒸馏微量法微量法水蒸汽蒸馏水蒸汽蒸馏常量常量K氏定氏定N法法l不需要精确知道体积l不需要标定浓度l弱酸对酸碱滴定要求低第44页/共57页食用菌中蛋白质检测微量微量K氏定氏定N法法原理及适用范围同前原理及适用范围同前与常量法不同点与常量法不同点 样品质量、试剂量变少样品质量、试剂量变少 微量滴定管微量滴定管 微量凯氏定氮微量凯氏定氮装置（水蒸气蒸馏）装置（水蒸气蒸馏）实验操作（1）消化最后加水定容到100ml,其他与常量法一样（2）蒸馏第45页/共57页食用菌中蛋白质检测微量微量K氏定氏定N法法（1）按图安装好微量定氮蒸馏装置（2）装水2/3甲基橙、硫酸数ml（保持酸性）（3）10ml4%硼酸

29、硼酸2滴混合指示剂滴混合指示剂（4）10.00ml样品消化稀释液（5）少量水冲洗（6）10ml10%氢氧化钠（7）少量蒸馏水冲洗，盖塞盖塞（8）加热蒸馏吸收液变为绿色计时蒸馏10min冷凝管提离液面继续蒸馏1min（9）滴定第46页/共57页第47页/共57页食用菌中蛋白质检测自动自动K氏定氏定N法法1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，数分钟完成1个样。第48页/共57页第49页/共57页第50页

30、/共57页食用菌中蛋白质检测1 1、原理、原理(标准曲线法标准曲线法)样品中的样品中的propro经经H H2 2SOSO4 4消化转化为铵盐溶液消化转化为铵盐溶液在在一一定定的的酸酸度度和和温温度度下下与与水水杨杨酸酸钠钠和和次次氯氯酸酸钠钠作用生成有颜色的化合物作用生成有颜色的化合物在在波波长长660nm660nm处处比比色色测测定定，求求出出样样品品含含氮氮量量，计计算蛋白质含量。算蛋白质含量。2 2、试剂、试剂水杨酸比色法水杨酸比色法第51页/共57页食用菌中蛋白质检测（1）氮标准溶液称经110干燥2h的硫酸铵0.4719g于烧瓶中定容10ml此液1ml相当于1.0mg氮标液使用时配制

31、成1ml相当于2.50g氮标液。（2 2）空白酸溶液）空白酸溶液称0.50g蔗糖加15mlH2SO4和5g催化剂与样品一样消化定容250ml使用时吸收此液10ml加水至100ml为工作液备用。水杨酸比色法水杨酸比色法硫酸铜硫酸钠（1：9）第52页/共57页食用菌中蛋白质检测3、实验步骤 （1）标准曲线的绘制水杨酸比色法水杨酸比色法取6个25ml容量瓶编号012345标准N溶液（2.5g/ml）01.02.03.04.05.0分别加空白酸液2ml分别加磷酸盐缓冲液5ml水稀释至15ml分别加水扬酸钠5ml37水浴15分钟加入次氯酸钠2.5ml37水浴15分钟取出试液于660nm下进行比色，绘标准

32、曲线。吸光度含N的质量g第53页/共57页食用菌中蛋白质检测3、实验步骤（2 2）样品处理水杨酸比色法水杨酸比色法准确称0.20-1.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾加大火力消化出现暗绿色摇动瓶子（瓶壁黏附的残渣溶解消化）溶液完全澄清冷却加水定容到250ml第54页/共57页食用菌中蛋白质检测3、实验步骤（3 3）样品测定水杨酸比色法水杨酸比色法准确吸取上述消化溶液10ml加水定容到100ml准确吸2ml加5ml磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同测A660水稀释至15ml分别加水扬酸钠5ml37水浴15分钟加入次氯酸钠2.5ml37水浴15分钟（4 4）计算）计算CF含氮%=-100W10001000C从标准曲线中查出测定样液的含氮量（g）F样品溶液的稀释倍数（？）W样品重量（g）pro%=总氮%K第55页/共57页食用菌中蛋白质检测4、注意事项(1)严格控制反应温度(温度对显色反应影响很大)(2)样品消化后当天应予以检测(重现性)(3)此法与K氏法结果基本一致水杨酸比色法水杨酸比色法第56页/共57页感谢您的观看！第57页/共57页