琼脂糖凝胶电泳原理步骤详细.pptx

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1、讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5第1页/共42页概述概述概述概述IntroductionIntroductionIntroductionIntroductionGel Gel Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresisElectrophoresisElectrophoresis ：由由由由琼琼琼琼脂脂脂脂、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。淀粉胶及聚

2、丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。特点（特点（特点（特点（characteristiccharacteristiccharacteristiccharacteristic）：）：）：）：1.1.1.1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动的孔中泳动的孔中泳动的孔中泳动2.2.2.2.电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快电泳操作方法简便，电泳速度快3

3、.3.3.3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰4.4.4.4.适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定适用于生化，免疫等定性定量测定 第2页/共42页琼脂糖凝胶（Agarose Gel）天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂果胶（agaropectin）Acid sulfateCarboxylic acid groups第3页/共42页 D-半乳糖3，6-脱水-L-半

4、乳糖琼脂糖（琼脂糖（AgaroseAgarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质半乳糖及其衍生物构成的中性物质第4页/共42页第5页/共42页讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5第6页/共42页 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点（一）优点（一）优点（一）优点（一）优点（advantage)advantage)advantage)advantage)1.1.1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎

5、消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.2.2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象3.3.3.3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质等大分子物质等大分子物质等大分子物质4.4.4.4.透明度较好，可直接或干

6、燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色5.5.5.5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.6.6.6.有热可逆性有热可逆性有热可逆性有热可逆性第7页/共42页（二）缺点（二）缺点（二）缺点（二）缺点(disadvantage)(disadvantage)(disadvantage)(disadvantage)1.1.1.1.机械强度差，易破碎机械

7、强度差，易破碎机械强度差，易破碎机械强度差，易破碎，浓度不能太低，浓度不能太低，浓度不能太低，浓度不能太低2.2.2.2.易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存易被细菌污染，不易保存，临用前配制，临用前配制，临用前配制，临用前配制3.3.3.3.琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖支支支支持持持持层层层层上上上上的的的的区区区区带带带带易易易易于于于于扩扩扩扩散散散散，电电电电泳泳泳泳后后后后必必必必须须须须立即固定染色立即固定染色立即固定染色立即固定染色4.4.4.4.与与与与PAGEPAGEPAGEPAGE相比，分子筛相比，分子筛相比，分子筛相比，分子筛(molecular

8、 sieve)(molecular sieve)(molecular sieve)(molecular sieve)作用作用作用作用小小小小，区带少，区带少，区带少，区带少第8页/共42页讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5第9页/共42页琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用Applications of Agarose GelApplications of Agarose

9、GelApplications of Agarose GelApplications of Agarose Gel Electrophoresis Electrophoresis Electrophoresis Electrophoresis 1.1.1.1.适适适适用用用用于于于于大大大大分分分分子子子子的的的的核核核核酸酸酸酸、核核核核蛋蛋蛋蛋白白白白等等等等的的的的分分分分离离离离、鉴鉴鉴鉴定及纯化定及纯化定及纯化定及纯化2.2.2.2.临临临临床床床床生生生生化化化化检检检检验验验验中中中中常常常常用用用用于于于于LDHLDHLDHLDH、CKCKCKCK等等等等同同同同工工工工酶酶酶

10、酶的的的的分离与检测分离与检测分离与检测分离与检测3.3.3.3.为为为为不不不不同同同同类类类类型型型型的的的的高高高高脂脂脂脂蛋蛋蛋蛋白白白白血血血血症症症症、冠冠冠冠心心心心病病病病等等等等提提提提供供供供生化指标生化指标生化指标生化指标 第10页/共42页ThegelwithUVillumination,theethidiumThegelwithUVillumination,theethidiumbromidestainedDNAglowsorangebromidestainedDNAglowsorange 第11页/共42页Digital image of 3 Digital ima

11、ge of 3 plasmid restriction plasmid restriction digests run on a 1%w/v digests run on a 1%w/v agarose gel,3 Volts/cm,agarose gel,3 Volts/cm,stained with ethidium stained with ethidium bromide.The DNA size bromide.The DNA size marker is a commercial marker is a commercial 1 1 kbp ladder.The kbp ladde

12、r.The position of the wells position of the wells and direction of DNA and direction of DNA migration is noted.migration is noted.第12页/共42页第13页/共42页讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5第14页/共42页影响迁移率的因素影响迁移率的因素Factors affecting mi

13、gration Factors affecting migration the size of the moleculethe size of the moleculeconformation of the molecule conformation of the molecule the agarose concentration of a gelthe agarose concentration of a gelVoltageVoltage第15页/共42页Percent agarose and resolution limits Percent agarose and resolutio

14、n limits 第16页/共42页讲课内容讲课内容 概述概述 1 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点 2 琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用 3 影响迁移率的因素影响迁移率的因素 4 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 5第17页/共42页琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白原理（原理（PrinciplePrinciple）血清脂蛋白经饱和苏丹黑血清脂蛋白经饱和苏丹黑B B预染后，以琼预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6pH8.6巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液中电泳，

15、根据各脂蛋白的组成、大小、形状中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。分离成不同区带。第18页/共42页(一一一一)血清脂蛋白血清脂蛋白血清脂蛋白血清脂蛋白(lipoprotein)lipoprotein)lipoprotein)lipoprotein)的组成的组成的组成的组成 ApoA ApoBApoA ApoBApoA ApoBApoA ApoBproteinproteinproteinprotein：Apoprotein Apoprotein Apoprotein Apoprotein ApoC ApoD ApoE ApoC ApoD ApoE ApoC ApoD ApoE

16、 ApoC ApoD ApoE 甘油三酯甘油三酯甘油三酯甘油三酯 （TGTGTGTG）脂类脂类脂类脂类 磷脂磷脂磷脂磷脂 （PLPLPLPL）游离胆固醇游离胆固醇游离胆固醇游离胆固醇 （FCFCFCFC）胆固醇酯胆固醇酯胆固醇酯胆固醇酯 （CECECECE）少量糖少量糖少量糖少量糖第19页/共42页第20页/共42页（二）分类（二）分类（二）分类（二）分类1.1.1.1.按电泳法分按电泳法分按电泳法分按电泳法分 乳糜微粒（乳糜微粒（乳糜微粒（乳糜微粒（chylomicron,CMchylomicron,CMchylomicron,CMchylomicron,CM）-脂蛋白脂蛋白脂蛋白脂蛋白 （

17、-lipoproteinlipoproteinlipoproteinlipoprotein）前前前前 -脂蛋白（脂蛋白（脂蛋白（脂蛋白（pre pre pre pre -lipoprotein-lipoprotein-lipoprotein-lipoprotein ）-脂蛋白脂蛋白脂蛋白脂蛋白 （-lipoproteinlipoproteinlipoproteinlipoprotein ）第21页/共42页2.2.2.2.按超速离心法分按超速离心法分按超速离心法分按超速离心法分 乳糜微粒乳糜微粒乳糜微粒乳糜微粒(chylomicron,CM)(0.94)chylomicron,CM)(0.94

18、)chylomicron,CM)(0.94)chylomicron,CM)(pI pI pI pI，各各各各种种种种脂脂脂脂蛋蛋蛋蛋白白白白均均均均带带带带负负负负电电电电，电电电电泳泳泳泳时时时时由由由由负负负负极极极极到到到到正正正正极极极极；VLDLVLDLVLDLVLDL为为为为圆圆圆圆形形形形，受受受受阻阻阻阻力力力力小小小小，LDLLDLLDLLDL形形形形态态态态不不不不规规规规则则则则，受受受受阻阻阻阻力力力力大大大大，所所所所以以以以VLDLVLDLVLDLVLDL跑在前跑在前跑在前跑在前第26页/共42页加样槽加样槽前前 CMLDLVLDLHDLCMLDLVLDLHDL+第

19、27页/共42页临床应用：高脂蛋白血症的分型临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM CM 前前 正常正常型型a a型型b b型型型型型型型型第28页/共42页操操 作作第29页/共42页玻璃片第30页/共42页第31页/共42页第32页/共42页预染色的标本预染色的标本第33页/共42页上样处上样处玻片玻片琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶第34页/共42页第35页/共42页第36页/共42页第37页/共42页CM第38页/共42页正常参考值（百分比）正常参考值（百分比）-脂蛋白脂蛋白 30-40%30-40%前前-脂蛋白脂蛋白 15%15%-脂蛋白脂蛋白 55%55%l l注意事项：血清样品要新鲜为了免去离心

20、步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清第39页/共42页名词解释名词解释名词解释名词解释1.1.1.1.迁移率迁移率迁移率迁移率2.2.2.2.电渗电渗电渗电渗3.3.3.3.电泳电泳电泳电泳问答题问答题问答题问答题1.1.1.1.影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？影响电泳迁移率的因素有哪些？2.2.2.2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。复习思考题复习思考题复习思考题复习思考题第40

21、页/共42页参 考 书 目临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验 第三版第三版第三版第三版 人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社 周新周新周新周新 主编主编主编主编电泳科学出版社电泳科学出版社电泳科学出版社电泳科学出版社 何忠效何忠效何忠效何忠效 张树政张树政张树政张树政 主编主编主编主编蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术 科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社 郭尧君郭尧君郭尧君郭尧君蛋白质技术手册蛋白质技术手册蛋白质技术手册蛋白质技术手册 科学出版社科学出版社科学出版社科学出版社 汪家政汪家政汪家政汪家政 范敏范敏范敏范敏 主编主编主编主编 第41页/共42页上海交通大学医学院感谢您的观看！第42页/共42页