生化蛋白质化学.pptx

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1、1什么是生物化学？什么是生物化学？生生物物化化学学是是用用化化学学的的原原理理和和方方法法，研研究究生生物物体体的的化化学学组组成成及及其其在在体体内内的的代代谢谢转转变变规规律律，从从而而阐阐明明生生命命现现象象本本质质的的一门科学。一门科学。第1页/共99页2学习内容学习内容生物大分子的结构与功能：生物大分子的结构与功能：蛋白质化学、核酸化学、酶蛋白质化学、核酸化学、酶物质代谢及其调节物质代谢及其调节 糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢、糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢、生物氧化、代谢联系与调节生物氧化、代谢联系与调节遗传信息的传递遗传信息的传递 DNA复制、复制、RNA转录、蛋白质生物合成、转录、蛋白

2、质生物合成、基因表达调控与基因工程基因表达调控与基因工程专题篇专题篇 肝胆生化、血液生化肝胆生化、血液生化第2页/共99页3生化学习方法与要求生化学习方法与要求基本概念要清楚基本概念要清楚勤于动手、善于思考、注意总结勤于动手、善于思考、注意总结课前认真预习课前认真预习课上认真听讲课上认真听讲课后及时、认真复习课后及时、认真复习第3页/共99页4参考书目l童坦君主编 生物化学 北京大学医学出版社，2003l查锡良主编.生物化学 7th 人卫出版社,2008l贾弘禔主编.生物化学 1st 人卫出版社,2005l贾弘禔主编.生物化学 3th 北大医学出版社，2005lBerg JM,Tymoczko

3、 JL&Stryer L.BIOCHEMISTRY 6th W.H.Freeman Co,2007lNelson DL&Cox MM.Lehninger Principles of Biochemistry 4th W.H.Freeman Co,2005中英文的生物化学均可参阅第4页/共99页5本课程的评估：实验 20分平时测验 10分考试 70分合计 100分第5页/共99页6核 酸：是遗传的物质基础第一篇 生物分子的结构与功能酶：生物催化剂蛋白质：是生命的物质基础第6页/共99页7第一章 蛋白质化学biochemistry of Protein蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成蛋白质的分子结

4、构蛋白质的分子结构蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质第7页/共99页8什么是蛋白质?蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。第8页/共99页9 第一节蛋白质在生命活动中的重要性 The importance of protein in the life生命活动的物质基础：生命活动的物质基础：除水以外，机体组织中最多的是蛋白质，占 人体干重的45%。多种生物学功能：多种生物学功能：催化功能：酶催化功能：酶 调节功能：多肽类激素调节功能：多肽类激素 收缩和运动功

5、能：肌肉蛋白收缩和运动功能：肌肉蛋白 运输和储存功能：血红蛋白运输和储存功能：血红蛋白 防御功能：免疫球蛋白防御功能：免疫球蛋白 第9页/共99页10第二节 蛋白质的分子组成蛋白质的元素组成蛋白质分子的基本结构单位氨基酸氨基酸的连接及连接产物：肽键和肽链蛋白质的分类第10页/共99页11平均16%一、主要元素组成C：50-55%H：6-8%O：19-24%N：13-19%S：0-4%其他:P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I等第11页/共99页12定氮法测量蛋白质含量依据是：蛋白质的平均含氮量为16每克样品的蛋白质含量（克）=每克样品的含氮量 6.25（100/16）题：已知一样品的含氮

6、量为0.04g克样品,请计算出此样品的蛋白质含量。答案：每克样品中蛋白质的含量：0.04g16%=0.04g 0.16=0.25g 0.04g X 6.25=0.25g第12页/共99页13二、蛋白质分子的基本结构单位：二、蛋白质分子的基本结构单位：氨基氨基酸酸 自然界中氨基酸有300300多种，但组成人体蛋白质的氨基酸只有2020种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。（一）氨基酸的结构(amino acid，aa)第13页/共99页14 HOHCRNHO2CH OCRNHOC3+_氨基酸结构通式：或第14页/共99页15甘氨酸不属于L-氨基酸，无不对称的C原子20第15页/共99页16（二）

7、氨基酸的分类（P4 表1-1）非极性疏水性氨基酸：具有非极性R侧链，呈疏水 性，包括脂肪族和芳香族氨基酸。（8种）不带电荷的极性氨基酸：具有极性R侧链，呈亲水 性，通常含羟基、巯基、酰胺基等。（7种）带正电荷的碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸（含氨基）（3种）带负电荷的酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸（含羧基）（2种）第16页/共99页171.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸第17页/共99页182.不带电荷的极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸 第18页/共99页19天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid G

8、lu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸目目 录录第19页/共99页20几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）第20页/共99页21 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH第21页/共99页22n蛋蛋白质的元素组成白质的元素组成:含含N量量 16%n蛋白质基本结构单位：蛋白质基本结构单位：L 氨基酸氨基酸n L氨基酸：甘氨酸（无不对称氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外）除外n

9、氨基酸结构通式：氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOHn 常见氨基酸种类：常见氨基酸种类：20种。种。小结第22页/共99页23氨基酸分类：酸性氨基酸：谷、天冬氨酸碱性氨基酸：组、赖、精氨酸不带电荷的极性氨基酸：7 甘、丝、苏、酪（羟基）、半胱氨酸（巯基）、谷氨酰胺、天冬酰胺非极性疏水性氨基酸：8 脂肪烃侧链：丙、缬、亮、异亮氨酸 芳香环侧链：苯丙、色氨酸 含S：蛋氨酸（甲硫氨酸）亚氨基：脯氨酸第23页/共99页24（三）氨基酸的理化性质1、两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质，既可解离成阳离子，也可解离成阴离子，解离方式取决于溶液的酸碱度。两性解离两性解离紫外吸收紫外吸收茚三酮反应茚三酮反

10、应第24页/共99页25等电点：isoelectric point,pI在某种pH环境中，氨基酸不解离或解离成阴、阳离子的程度及趋势相等，静电荷为0，此pH为该氨基酸的等电点。R-CH-COOHNH2R-CH-COO NH3+R-CH-COO NH2R-CH-COOHNH3+氨基酸的兼性离子pH=pI阳离子pH pIOH H+OH H+第25页/共99页26问题某氨基酸的等电点是5.1，它在PH=8.0的溶液中带何种电荷？在PH=2.0的溶液中带何种电荷？答：在PH=8.0的溶液中带负电；（pHpI）在PH=2.0的溶液中带正电。(pHpI)第26页/共99页27等电点的计算：R为非极性基团（

11、R为非游离基团）pI=1/2（pK1+pK2）如：甘氨酸pK-COOH=2.34，pK-NH2=9.60 pI=1/2（2.34+9.6）=5.97第27页/共99页28R为极性基团为极性基团 酸性酸性aa：pI=1/2（pK-COOH+pKR）如：天冬氨酸如：天冬氨酸 pI=（pK-COOH+pKR）=（2.09+3.86）=2.98 碱性碱性aa：pI=1/2（pK-NH2+pKR）如：赖氨酸如：赖氨酸 pI=（pK-NH2+pKR）=（8.95+10.53）=9.74第28页/共99页292、紫外吸收性质：280 nm色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm280nm波长附近具有最大吸收峰常

12、用于蛋白质含量测定第29页/共99页303、茚三酮反应氨基酸定量分析（A570）加热第30页/共99页31三、肽键和多肽链 1.肽键peptide bond：一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱水缩合形成的键称为水缩合形成的键称为肽键肽键 (共价键共价键)。也称酰胺键。NH2 CH C OHOH-NH CH C OHO+NH2 CH C NH-CH-C-OHR1OOR 2R 2R1H2O（一）.氨基酸的成肽反应第31页/共99页322.肽：氨基酸借肽键相互连接形成的化合物两个aa组成的肽叫二肽三个aa组成的肽叫三肽多个aa组成的肽叫多肽氨基酸借肽键连成长

13、链，成为多肽链寡肽（氨基酸残基 10）（肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合，基团不全称为氨基酸残基）（肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合，基团不全称为氨基酸残基）第32页/共99页333.肽链两端:氨基末端（N-terminal,N末端）羧基末端（C-terminal,C末端）4.肽链中的aa的排列顺序，一般-NH2端开始，N C，即多肽链有方向性，N端为头，C端为尾 NH2 CH C OHOH-NH CH C OHO+NH2 CH C NH-CH-C-OHR1OOR 2R 2R1H2O第33页/共99页34+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键第34页/共99页35（二（二).生物活性肽生物活性肽glutath

14、ione（GSH）谷胱甘肽）谷胱甘肽谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸作用：体内重要的还原剂第35页/共99页36 多肽类激素、神经肽 催产素（9肽）加压素（9肽）促肾上腺皮质激素（39肽）脑啡肽（5肽）强啡肽（17肽）-内啡肽（31肽）第36页/共99页37四、蛋白质分类 单纯蛋白质（只含氨基酸）：白蛋白，球蛋白，组蛋白，精蛋白白蛋白，球蛋白，组蛋白，精蛋白 结合蛋白质（除氨基酸，还有辅基：糖、脂、磷酸、金属离子等）核蛋白，色蛋白，糖蛋白，脂蛋白，磷蛋白，金属蛋白。核蛋白，色蛋白，糖蛋白，脂蛋白，磷蛋白，金属蛋白。（一）按组分分类（二）按形状或空间构象分类 纤维状蛋白质（水溶性差，多为结构蛋白）球状蛋

15、白质（易溶于水，多为功能蛋白）第37页/共99页38第三节 蛋白质的分子结构 高级结构或空间结构二级结构三级结构四级结构一级结构基本结构第38页/共99页39一、蛋白质的一级结构 primary structure概念：蛋白质分子中氨基酸的组成和排列顺序。基本结构键：肽键 peptide bond，有些还有二硫键 disulfide bridges人胰岛素一级结构：A链（21aa)、B链（30aa)H2N-甘-异-缬-谷-谷胺-半-半-苏-丝-异-半-丝-亮-酪-谷胺-亮-谷-天胺-酪-半-天胺-COOHH2N-苯-缬-天胺-谷胺-丝-亮-半-甘-丝-组-亮-缬-谷-丙-亮-酪-亮-缬-半-甘

16、-谷 -精-甘-苯-苯-酪-苏-脯-赖-苏-COOHSSABSSSS第39页/共99页40 二.蛋白质分子的空间结构二级结构二级结构Secondary Structure三级结构三级结构Tertiary Structure四级结构四级结构Quaternary Structure第40页/共99页41（一）（一）、蛋白质分子的二级结构、蛋白质分子的二级结构 指多肽链骨架原子的局部空间排列，指多肽链骨架原子的局部空间排列，不涉及侧链构象不涉及侧链构象稳定结构的主要化学键氢键 蛋白质主链以肽键平面为基本单位，经折叠或盘曲所形成的局部空间构象，蛋白质二级结构的主要形式：-螺旋 -折叠（-片层）-转角

17、无规卷曲第41页/共99页42肽键（CO-NH）具有双键性质,参与形成肽键的4个原子（C，O，N，H）和相邻的两个 碳原子位于同一平面，构成一个肽单元。1 1、肽键平面（也称肽单元）peptide unit CN，半双键性（，半双键性（partial double-bond character），不能旋转），不能旋转C C、N C，真正单键（，真正单键（pure single bond），可以旋转），可以旋转第42页/共99页43第43页/共99页442 2、-螺旋螺旋（-Helix）(Pauling,Corey,1951)特点 -螺旋与-折叠是蛋白质二级结构的主要 形式n右手螺旋：多肽链主链

18、围绕中心轴螺旋式上升右手螺旋：多肽链主链围绕中心轴螺旋式上升n3.6个个AA/圈，螺距圈，螺距0.54nm；n氢键维系：链内氢键（氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长），平行长轴；轴；n侧链伸出，在螺旋外侧侧链伸出，在螺旋外侧第44页/共99页4549第45页/共99页46 特点n 多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；n 氢键维系：氢键的方向垂直长轴；氢键维系：氢键的方向垂直长轴；n 侧链伸出、位于侧链伸出、位于“锯齿锯齿”状结构的上下方；状结构的上下方；n 由一条多肽链形成，也可由多条肽链顺平行或反平行形成。由一条多肽链形成，也可由多条肽链顺平行或反

19、平行形成。3.-折叠（-片层，-pleated sheets）(Pauling,1951)第46页/共99页47第47页/共99页48第48页/共99页494、-转角和无规卷曲-转角（-bend or -turn)：蛋白质分子中，肽链进行1800回折时出现的结构。无规卷曲：指没有确定性规律的肽链结构。-转角分类：I型，中间肽单元的氧原子与侧链R2、R3呈反式位置。II型，中间肽单元的氧原子与侧链R2、R3呈顺式位置第49页/共99页50第50页/共99页51（二）蛋白质的三级结构 指一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。主要化学键：疏水键、离子键

20、、氢键、范德华引力、二硫键 尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。第51页/共99页52特点：特点：n 空间长度缩短，呈球状、棒状、纤维状空间长度缩短，呈球状、棒状、纤维状n 三级结构主要靠次级键（非共价键）维系固定：三级结构主要靠次级键（非共价键）维系固定：疏水键疏水键、离子键、氢键、离子键、氢键、范德华力；二硫键（共价键）也参与维系三级结构范德华力；二硫键（共价键）也参与维系三级结构n 疏水基团在分子内部，亲水基团在分子表面疏水基团在分子内部，亲水基团在分子表面n 功能区形成：三级结构形成后，生物学活性必需基团靠近，形成活性中功能区形成：三级结构形成后，生物学活性必需基团靠近，形成

21、活性中心或部位心或部位。第52页/共99页53第53页/共99页54 肌红蛋白（Mb）153aa,单个肽链，8个螺旋区第54页/共99页55（三）蛋白质的四级结（三）蛋白质的四级结构构具有独立三级结构的多肽链单位，称为具有独立三级结构的多肽链单位，称为亚基亚基或或亚单位亚单位，亚基可以相同，亦可以不同。亚基可以相同，亦可以不同。次级键包括离子键、氢键等次级键包括离子键、氢键等单单独独亚亚基基，多多无无生生物物学学功功能能，具具有有完完整整四四级级结结构构的的蛋蛋白质，白质，才有生物学功能。才有生物学功能。二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，成为有一定立体排布和空间关系的

22、结构，称为四级结构第55页/共99页56 血红蛋白（Hb）两个链与两个链组成的四聚体 链：链：141aa；链：链：146aa;每条链每条链各含一个血红素辅基各含一个血红素辅基链链链链第56页/共99页57第57页/共99页58小结小结高级结构或空间构象四级结构三级结构二级结构一级结构氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质第58页/共99页59氨基酸的理化性质：氨基酸的理化性质：等电点等电点紫外吸收紫外吸收等电点（isoelectric point,pI）：在某种pH环境中，氨基酸不解离或解离成阴、阳离子的程度及趋势相等，静电荷为0，此pH为该氨基酸的等电点。第59页/共99页60 一级结构一级结构是

23、指蛋白质分子中氨基酸的组成和是指蛋白质分子中氨基酸的组成和 排列顺序。基本结构键：肽键，还有二硫键排列顺序。基本结构键：肽键，还有二硫键 蛋白质的二级结构：蛋白质的二级结构：多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链构象，主要有主要有-螺旋、螺旋、-折叠、折叠、-转角和无规则卷曲。转角和无规则卷曲。稳定结构键：主要为氢键。稳定结构键：主要为氢键。45o 肽键：一个氨基酸的肽键：一个氨基酸的羧基羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合形成的键，也称酰胺和另一个氨基酸的氨基脱水缩合形成的键，也称酰胺键。键。o 多肽链的方向性：多肽链的方向性：N C 两端两端:N末端，末端，C末端末端第60页/共99页61

24、特点：右手螺旋：特点：右手螺旋：3.6个个AA/圈，螺距圈，螺距0.54nm；氢键维系：链内氢键（氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长轴；），平行长轴；侧链伸出，在螺旋外侧侧链伸出，在螺旋外侧1.-螺旋螺旋（-Helix）672.-片层（-pleated sheets），也称 -折叠特点n 多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；n 氢键维系：氢键的方向垂直长轴；氢键维系：氢键的方向垂直长轴；n 侧链伸出、位于片层侧链伸出、位于片层“锯齿锯齿”的上下方；的上下方；n 由一条多肽链形成，也可由多条肽链顺平行或反平行形成。由一条多肽链形成，也可由多条肽链顺平行

25、或反平行形成。第61页/共99页62 蛋白质的三级结构：一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布，称为三级结构，是包括主、侧链在内的空间排列。三级结构主要靠次级键三级结构主要靠次级键（非共价键）维系，主要是（非共价键）维系，主要是疏水键疏水键蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构：二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，成为有一定立体排布和空间关系的结构，称为四级结构。亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力力68第62页/共99页63第四节 蛋白质结构与功能的关系各种蛋白质均有其特定功能蛋白质

26、功能由其空间结构决定空间结构由一级结构决定蛋白质的一级结构和空间结构均与蛋白质的功能有关第63页/共99页64一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 Primary structure and function（一）一级结构是空间构象的基础，决定功能。RNase是由是由124aa残基组成的单肽链，分子中残基组成的单肽链，分子中 8 个个Cys的的-SH构成构成4对二对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质第64页/共99页65 天然状态，有催化活性 尿素、-巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性第65页/共99页66（二）一级结构

27、是蛋白质功能的基础 1、相似结构表现相似的功能、不同结构具有不同功能：抗利尿激素 H2N半胱酪苯丙谷天冬半胱脯精甘 催产素 H2N半胱酪异亮谷天冬半胱脯亮甘催产素对子宫平滑肌和乳腺导管的收缩作用抗利尿激素 催产素对血管平滑肌的收缩效应和利尿作用抗利尿激素 （1）第66页/共99页672.蛋白质一级结构的种属差异与分子进化 对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果，但与活性和蛋白质空间结构密切相关的氨基酸残基高度保守第67页/共99页68第68页/共99页69分子病：由于遗传物质（DNA）的突变，导致其编码的蛋白 质分子的氨基酸序列异常，

28、而引起其功能改变的遗 传性疾病。镰刀形红细胞贫血：1944年首先被发现并被称为分子病。正常的红细胞正常的红细胞异常的红细胞异常的红细胞3、一级结构的改变与分子病第69页/共99页70 正常：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-（谷）病人：N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-（缬）Hb 链镰刀型红细胞贫血病因：第70页/共99页71二、蛋白质的空间构象与功能的关系蛋白质空间结构是其生物学活性的基础，构象发生改变，其功能活性也随之改变。例1：核糖核酸酶RNase是由124aa残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键

29、，形成具有一定空间构象的蛋白质。第71页/共99页72 天然状态，有催化活性 尿素、-巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇非折叠状态，无活性第72页/共99页73第一个亚基结合O2后，亚基的构象会发生改变，可促进其它亚基与O2的结合例2：血红蛋白（2 2）结构:2、2 功能:携 O2，血红素为辅基，携带O2，亚基之间及内部有8对离子键，形成亲水的球状蛋白。第73页/共99页74HbHb的的4 4个亚基与个亚基与4 4个个O O2 2结合结合的平衡常数不同，通常第的平衡常数不同，通常第一个亚基结合一个亚基结合O O2 2后，可促进其它亚基与后，可促进其它亚基与O O2 2的结合。的结合。协同效应变构效

30、应变构剂变构蛋白O2HbHb与与O O2 2后后HbHb的构象变化的构象变化第74页/共99页75蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致致疾疾病病发生。发生。第75页/共99页76疯牛病由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起。PrP 分子量：33-35kD 正常含多个-螺旋（PrPc），致病PrP全变成-折叠（PrPsc），导致神经退行性变。疾病与DNA和RNA无关。第

31、76页/共99页77第五节 蛋白质的理化性质及分离纯化一、两性解离和等电点体内多数蛋白质pI为pH5.0，体液pH7.4,阴离子？阳离子?等电点（pI）：在某一pH溶液中，蛋白质不解离或解离成 阴、阳离子的程度和趋势相等，成为兼性离子（正、负电荷正好相等），净电荷为零，此pH值 称为该蛋白质的等电点。PNH3+COOHPNH3+COO PNH2COO OH-H+OH-H+pH pI第77页/共99页78依此进行蛋白质的分离依此进行蛋白质的分离纯化：纯化：l 等电点沉淀法等电点沉淀法l 电泳法电泳法l 离子交换层析离子交换层析82第78页/共99页79二、蛋白质的高分子性质 高分子化合物，在水溶

32、液中呈胶体状态，扩散慢 易沉降 粘度大 不能透过半透膜第79页/共99页801、维持蛋白质胶体溶液稳定的2要素:水化膜 表面电荷 蛋白质表面的亲水基团与水分子形成水化膜，使蛋白质分子相互隔开，不易沉淀；在一定的pH溶液中，蛋白质分子表面带有同种电荷，使 蛋白质分子相互排斥，防止聚集。+第80页/共99页81+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的沉淀第81页/共99页822.蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化(1)dialysis(透析透析)与与ultrafiltratio

33、n(超滤法超滤法)(2)ultracentrifugation超速离心超速离心 dx/dt沉降系数沉降系数S=-x 1013 2x第82页/共99页83三、蛋白质的沉淀：precipitation1、盐析法 高浓度的中性盐可以沉淀水溶液中的蛋白质。硫酸铵、硫酸钠、亚硫酸钠、氯化钠 原理：破坏水化膜、中和电荷蛋白质的分离纯化 不同种类的蛋白质盐析时所需盐浓度不同 饱和硫酸铵：清蛋白半饱和硫酸铵：球蛋白、纤维蛋白原饱和氯化钠：纤维蛋白原例：分离血浆蛋白质蛋白质从溶液中溶液中析出的现象。第83页/共99页842、重金属盐沉淀 Ag+、Hg2+、Cu2+、Pb2+原理：中和负电荷（pH pI）应用：给

34、重金属中毒病人口服大量乳品或鸡蛋清3、生物碱试剂与某些酸沉淀：苦味酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸、硝酸 应用：临床制备无蛋白血滤液4、有机溶剂沉淀 乙醇、甲醇、丙酮 原理：破坏水化膜第84页/共99页85四、蛋白质的变性 Denaturation 在某些理化因素的作用下，蛋白质的空间构象破坏，导致蛋白质理化性质和生物学性质改变，但一级结构未发生改变。天然蛋白质结构变性蛋白质结构蛋白质变性实质：次级键断裂 肽键不变第85页/共99页86变性因素：变性因素：1）物理因素：高温、高压、射线等）物理因素：高温、高压、射线等2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等 变性后的表现：

35、变性后的表现：1）理化性质改变）理化性质改变2）生物学活性丧失）生物学活性丧失变性的实际意义：变性的实际意义：防止变性防止变性-低温保存疫苗、酶等蛋白质制品低温保存疫苗、酶等蛋白质制品 利用变性利用变性-消毒、灭菌、消毒、灭菌、血滤液制备第86页/共99页87五、蛋白质的呈色反应 茚三酮反应 蛋白质溶液在pH57之间，与茚三酮溶液作用呈 蓝紫色。蛋白质肽键OH-CuSO4紫红色混合物肽键类似于双缩脲结构H2N-C-N-C-NH2OOH 双缩脲反应 酚试剂反应 碱性条件下，蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸可 与酚试剂反应生成蓝色化合物。常用于蛋白质的定性与定量分析第87页/共99页88六、蛋白质的紫

36、外吸收特征蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外线原因：芳香族氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在280nm280nm波长附近具有最大吸收峰常用于蛋白质含量测定第88页/共99页89第六节蛋白质的一级结构测定1、Analysis on the constitutes of aa 组成分析 标准水解法：用6N HCl，于100-120下，在真空按瓶中进行。水解时间为10-24 hr。水解后去除过量的HCl，得到aa混合物，然后用层析或电泳法分析各种aa的百分率，再根据MW，可初步计算出被测蛋白质的aa组成第89页/共99页90第90页/共99页912、Analysis of terminal amino

37、acid 末端氨基酸分析 肽链末端aa的鉴定可用化学法或酶法。如用氨基肽酶或羧肽酶，可特异的从肽链N-端或C-端一个个水解下aa，再一个个分析鉴定。化学法有DNFB法、Dansyl-Cl法,Edman降解法。第91页/共99页92第92页/共99页93N-末端分析 a、DNFB 与N-端aa结合肽链 DNP-多肽（黄色）b、Dansyl-cl aa残基不能与之结合 Dansyl-aa（有荧光）c、Edman法：OH-结合 H+降解PITC+肽（n aa）PTC多肽 PTH-aa +肽（n-1aa）异硫氰 苯氨基 苯乙内 酸苯酯 硫甲酰基肽 酰硫脲衍生物 1、PTH-aa可用气液色谱法鉴定为何种

38、aa 2、剩下的肽链仍是完整的，自由-NH2又可与试剂结合 3、这样一 一分析，即可知小肽段中aa的排列顺序第93页/共99页94C-末端分析1）化学法：肼解法无水肼与肽链中每个aa残基结合，并使其从长肽链上解离下来成为氨基酰肼，不能与肼结合的游离aa残基即为C端aa。2）羧肽酶法：羧肽酶A、B只能水解C端有自由-COOH的肽键，酶从C端一个个aa往下切。第94页/共99页953.蛋白质的aa排列顺序的决定 将蛋白质部分水解成为肽段，再逐个鉴定各肽段的aa序列，将各肽段连接起来即可。方法：用两种（或以上）不同方法水解蛋白质，因水解部位不同，可得到两系列不同的小肽段，再从两系列中找出关键性的重叠

39、的肽段，即可将肽段连接得到蛋白质序列。方法方法1方法方法2第95页/共99页964.蛋白质空间结构测定蛋白质空间结构测定圆二色光谱圆二色光谱X射线衍射法（射线衍射法（X-ray diffraction）磁共振技术磁共振技术结构预测结构预测第96页/共99页97本章重点 蛋白质的分子组成：元素、氨基酸；蛋白质的分子结构：一级、二级、三级、四级；蛋白质结构与功能的关系；基本概念：肽链、肽键、等电点、蛋白质变性第97页/共99页98蛋白质元素组成特点；多肽链基本组成单位；肽键；蛋白质的两性解离；蛋白质的等电点；蛋白质的变性；试述蛋白质一级结构和高级结构的概念及维持各级结构的键和力；举例说明蛋白质结构和功能的关系及生理意义；举例说明什么是蛋白质变性作用？有哪些实际应用？举例说明什么是分子病？思考题思考题第98页/共99页99感谢您的观看！第99页/共99页