扫描电子显微镜的样品制备技术学习教案.pptx

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1、扫描电子显微镜的样品扫描电子显微镜的样品(yngpn)制备技术制备技术第一页，共61页。6.1 SEM样品(yngpn)制备的基本要求 SEM对样品基本要求：基本性质：干净、干燥、导电、不发光、不发热、磁性弱。大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度(god)在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。第1页/共60页第二页，共61页。对对试试样样的的要要求求试试样样可可以以是是块块状状或或粉粉末末颗颗粒粒，试试样样大大小小要要适适合合仪仪器器专专用用样样品品座座的的尺尺寸寸，不不能能过过大大。样样品品座座尺尺寸寸各各仪仪器器不不尽尽相相同同，一一般般小小的的样样品品座座为为 3

2、3 5mm 5mm，大大的的样样品品座座为为 30 30 50mm 50mm，以以分分别别用用来来放放置置不不同同大大小小的的试试样样，样样品的高度也有一定的限制，一般在品的高度也有一定的限制，一般在 5 5 10mm 10mm 左右。左右。表表面面受受到到污污染染的的试试样样，要要在在不不破破坏坏试试样样表表面面结结构构的的前前提提下下进行适当清洗，然后干燥。进行适当清洗，然后干燥。新新断断开开的的断断口口(dunku)(dunku)或或断断面面，一一般般不不需需要要进进行行处处理理，以以免免破破坏坏断断口口(dunku)(dunku)或或表表面面的的结结构构状状态态。有有些些试试样样的的表

3、表面面、断断口口(dunku)(dunku)需需要要进进行行适适当当的的侵侵蚀蚀，才才能能暴暴露露某某些些结结构构细细节节，则则在在侵侵蚀蚀后后应应将将表表面面或或断断口口(dunku)(dunku)清清洗洗干干净净，然然后后烘干。烘干。要要求求在在真真空空中中能能保保持持稳稳定定，含含有有水水分分的的试试样样应应先先干干燥燥除除去去水分。水分。对对磁磁性性试试样样要要预预先先去去磁磁，以以免免观观察察时时电电子子束束受受到到磁磁场场的的影影响。响。要求导电，不导电的观察前进行导电处理。要求导电，不导电的观察前进行导电处理。第2页/共60页第三页，共61页。块块块块状状状状试试试试样样样样扫扫

4、扫扫描描描描电电电电镜镜镜镜的的的的试试试试样样样样制制制制备备备备是是是是比比比比较较较较简简简简便便便便的的的的。对对对对于于于于块块块块状状状状导导导导电电电电(dodin)(dodin)材材材材料料料料，除除除除了了了了大大大大小小小小要要要要适适适适合合合合仪仪仪仪器器器器样样样样品品品品座座座座尺尺尺尺寸寸寸寸外外外外，基基基基本本本本上上上上不不不不需需需需要要要要进进进进行行行行什什什什么么么么制制制制备备备备，用用用用导导导导电电电电(dodin)(dodin)胶胶胶胶把把把把试试试试样样样样粘粘粘粘结结结结在在在在样样样样品品品品座座座座上上上上，即即即即可可可可放放放放在

5、在在在扫扫扫扫描描描描电电电电镜镜镜镜中中中中观观观观察察察察。对对对对于于于于块块块块状状状状的的的的非非非非导导导导电电电电(dodin)(dodin)或或或或导导导导电电电电(dodin)(dodin)性性性性较较较较差差差差的的的的材材材材料料料料，要要要要先先先先进进进进行行行行镀镀镀镀膜膜膜膜处处处处理理理理，在在在在材材材材料料料料表表表表面面面面形形形形成成成成一一一一层层层层导导导导电电电电(dodin)(dodin)膜膜膜膜。以以以以避避避避免免免免电电电电荷荷荷荷积积积积累累累累，影影影影响响响响图图图图象象象象质质质质量量量量。并并并并可可可可防防防防止止止止试试试试样

6、样样样的的的的热热热热损伤。损伤。损伤。损伤。6.1.26.1.2块状试样块状试样(sh(sh yn)yn)的制备的制备第3页/共60页第四页，共61页。6.1.36.1.3粉体试样粉体试样(sh(sh yn)yn)的制备的制备粉粉体体可可以以直直接接撒撒在在样样品品座座的的双双面面碳碳导导电电胶胶上上，用用平平的的表表面面物物体体，例例如如玻玻璃璃板板压压紧紧，然然后后用用洗洗耳耳球球吹吹去去粘粘结结不牢固的颗粒。不牢固的颗粒。对对细细颗颗粒粒的的粉粉体体分分析析时时，特特别别是是形形貌貌观观察察时时，将将粉粉体体用用酒酒精精或或水水在在超超声声波波清清洗洗机机内内分分散散(fnsn)(fn

7、sn)，再再用用滴滴管管把把均均匀匀混混合合的的粉粉体体滴滴在在样样品品座座上上，待待液液体体烘烘干干或或自自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。第4页/共60页第五页，共61页。在制备在制备在制备在制备SEMSEM样品时，必须掌握以下原则：样品时，必须掌握以下原则：样品时，必须掌握以下原则：样品时，必须掌握以下原则：(1)(1)每每每每一一一一操操操操作作作作过过过过程程程程，都都都都应应应应注注注注意意意意防防防防止止止止样样样样品品品品的的的的污污污污染染染染和和和和损损损损伤伤伤伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；使

8、被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构；(2)(2)去去去去除除除除样样样样品品品品内内内内水水水水份份份份，以以以以利利利利于于于于维维维维持持持持SEMSEM的的的的真真真真空空空空度度度度和和和和防防防防止止止止镜镜镜镜筒筒筒筒的的的的污污污污染染染染。但但但但在在在在脱脱脱脱水水水水和和和和干干干干燥燥燥燥处处处处理理理理时时时时，要要要要尽尽尽尽量量量量减减减减少少少少(jinsho)(jinsho)避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；避免样品体积变

9、小和收缩变形等人工假象；避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；(3)(3)降降降降低低低低样样样样品品品品表表表表面面面面的的的的电电电电阻阻阻阻率率率率，增增增增加加加加样样样样品品品品的的的的导导导导电电电电性性性性能能能能，以以以以提提提提高高高高二二二二次次次次电电电电子子子子发发发发射射射射率率率率，建建建建立立立立适适适适度度度度的的的的反反反反差差差差和和和和减减减减少少少少(jinsho)(jinsho)样品的充放电效应；样品的充放电效应；样品的充放电效应；样品的充放电效应；(4)(4)观观观观察察察察组组组组织织织织细细细细胞胞胞胞的的的的表表表表面面面面或或或或内内内内部部

10、部部微微微微结结结结构构构构，应应应应注注注注意意意意和和和和保保保保护样品的观察面。护样品的观察面。护样品的观察面。护样品的观察面。第5页/共60页第六页，共61页。6.1.46.1.4常规常规常规常规(chnggu)(chnggu)生物样品制备技术生物样品制备技术生物样品制备技术生物样品制备技术制备过程如下：制备过程如下：取取材材 根根据据需需要要，切切取取适适当当大大小小的的样样品品。专专门门的的SEMSEM备备有有灵灵活活可可动动，范范围围较较大大的的样样品品台台，样样品品可可大大些些。装装在在透透射射电电镜镜上上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在的扫描附件，活动范围较小，样品直径

11、应在3 34mm4mm左右。左右。漂漂洗洗 用用缓缓冲冲液液把把组组织织表表面面洗洗净净，否否则则会会影影响响(yngxing)(yngxing)正正常常形形态态，但但以以快快速速和和轻轻巧巧为为宜宜，尽尽量量保保护护器器官官或或组组织织的的表表面面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。固固定定 用用2.52.55 5戊戊二二醛醛/缓缓冲冲液液在在室室温温或或4 4摄摄氏氏度度下下前前固固定定。具具体体时时间间可可根根据据样样品品的的需需要要而而定定，一一般般单单细细胞胞10-3010-30分分钟钟，较较大的或较硬的样品可达大的或较硬的样品可达1-2h

12、1-2h或更长时间。或更长时间。漂洗漂洗 用缓冲液洗用缓冲液洗3 3次，洗去未结合的戊二醛。次，洗去未结合的戊二醛。重重固固定定 1 1锇锇酸酸/缓缓冲冲液液4 4摄摄氏氏度度下下后后固固定定101060min60min。有有时时为为了了提提高高样样品品的的反反差差和和固固定定效效果果，可可以以综综合合固固定定液液，如如随随意意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用。选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用。第6页/共60页第七页，共61页。漂洗漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。用缓冲液洗去未结合的锇酸。脱水脱水 用用3030、5050、7070、8080、9090、959

13、5、100100、100100丙酮或乙醇溶液各丙酮或乙醇溶液各10-1510-15分钟，大于分钟，大于1mm1mm的样品可脱的样品可脱水水10102020分钟。分钟。干燥干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或燥或4545热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，其中其中(qzhng)(qzhng)

14、临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。导电导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理第7页/共60页第八页，共61页。6.2.16.2.1固定固定(gdng)(gdng)与与脱水脱水样样品品的的固固定定：为为了了把把生生物物样样品品的的微微细细结结构构和和外外部部形形态态真真实实的的保保留留下下来来，SEMSEM样样品品必必须须进进行行固固定定处处理理。通通过过固固定定还还可可以以使使组组织织硬硬化化，从从而而增增强强样样品品在在干干燥燥过过程程中中耐耐受受表表面面张张力力变变化化发发生生龟龟裂裂，还还能能提提高高样样品

15、品耐耐受受电电子子束束轰轰击击的的能能力力。常常用用的的固固定定剂剂为为醛醛类类和和四四氧氧化化锇锇，还还有有多多聚聚甲甲醛醛和和高高锰锰酸酸钾钾等等。固固定定的的方方式式有有浸浸泡泡固固定定、灌灌注注固固定定、微波和化学混合固定。微波和化学混合固定。脱脱水水处处理理：对对保保证证金金属属镀镀膜膜装装置置(zhungzh)(zhungzh)和和电电镜镜的的镜镜筒筒真真空空度度和和防防止止样样品品在在高高真真空空状状态态下下的的龟龟裂裂和和变变形形等等有有重重要要的的作作用用。采采用用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。第8页/

16、共60页第九页，共61页。6.2.2 6.2.2 样品样品(yngpn)(yngpn)的干燥：的干燥：1.1.自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到以及微小材料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到100100，在大，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为脱水剂的表面张力系

17、数比气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水剂中不会过多变形而影响其结构。水小所以样品在脱水剂中不会过多变形而影响其结构。2.2.真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪内，在低真空状态下真空干燥法：是直接将固定及脱水的样品放入真空镀膜仪内，在低真空状态下使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。使样品内的溶液逐步挥发，当达到高真空时样品即可干燥，随后进行金属镀膜。这一方法简单易行，但是仍存在一定的表面张力问题，固在缺少其它这一方法简单易行，但是仍存在一定的表面张力问题，固在缺少其它(qt)(qt)的干燥的干

18、燥手段时才选用。手段时才选用。第9页/共60页第十页，共61页。3 3 临临界界点点干干燥燥：目目前前最最理理想想(lxing)(lxing)的的简简单单的的干干燥燥法法。临临界界点点干干燥燥仪仪利利用用物物质质在在临临界界状状态态下下液液体体表表面面张张力力逐逐渐渐被被消消除除的的特特性性，减减少少样样品品干干燥燥过过程程中中的的变变形形和和收收缩缩，从从而而达达到到样样品的完全干燥。品的完全干燥。4 4 冷冷冻冻干干燥燥：在在此此过过程程中中，样样品品中中的的水水分分直直接接由由冰冰态态升升华华为为气气态态，样样品品也也不不受受表表面面张张力力的的影影响响。但但这这种种方方法法的的不不足足

19、之之处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。处是样品中的水分易形成冰晶而破坏超微结构。第10页/共60页第十一页，共61页。6.2.3 6.2.3 临界点干燥临界点干燥(gnzo)(gnzo)临临临临界界界界点点点点：在在在在一一一一定定定定的的的的温温温温度度度度和和和和压压压压力力力力下下下下，某某某某物物物物质质质质的的的的液液液液态态态态和和和和气气气气态态态态界界界界面面面面消消消消失失失失，由由由由液液液液态态态态瞬瞬瞬瞬间间间间转转转转化化化化为为为为气气气气态态态态，此此此此时时时时的的的的温温温温度度度度即即即即该该该该物物物物质质质质的的的的临临临临界界界界点点点点温温温

20、温度度度度（C.TC.T），同同同同时时时时也也也也是是是是该该该该物物物物质质质质的的的的临临临临界界界界点点点点（C.PC.P）。而而而而此此此此时时时时的的的的压压压压力力力力和和和和该该该该物物物物质质质质的的的的密密密密度度度度称称称称为为为为临临临临界界界界压压压压力力力力和和和和临临临临界界界界密密密密度度度度。不不不不同同同同的的的的物物物物质质质质有有有有各各各各自自自自(gz)(gz)的的的的临临临临界界界界点点点点和和和和临临临临界界界界压压压压力力力力。在在在在临临临临界界界界点点点点时时时时表表表表面面面面张张张张力力力力作作作作用用用用消消消消失失失失，分分分分子子

21、子子之之之之间间间间的的的的内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。内聚力等于零。临界点干燥仪的设计就依据了这种物理性质。干干干干燥燥燥燥剂剂剂剂：考考考考虑虑虑虑到到到到生生生生物物物物样样样样品品品品有有有有限限限限的的的的承承承承受受受受力力力力，一一一一般般般般选选选选择择择择低低低低温温温温和和和和低低低低压压压压临临临临界界界界点点点点的的的的干干干干燥燥燥燥剂剂剂剂.有有有有多多多多种种种种物物物物质质质质可可可可以以以以作作作作为为为为临临临临界界界界点点点

22、点干干干干燥燥燥燥的的的的干干干干燥燥燥燥剂剂剂剂，如如如如：液液液液态态态态二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳、干干干干冰冰冰冰（固固固固体体体体二二二二氧氧氧氧化化化化碳碳碳碳）、氟氟氟氟利利利利昂昂昂昂以以以以及及及及一一一一氧氧氧氧化化化化二二二二氮氮氮氮。最最最最常用的为液态二氧化碳。常用的为液态二氧化碳。常用的为液态二氧化碳。常用的为液态二氧化碳。第11页/共60页第十二页，共61页。常用常用(chn yn)(chn yn)几种干燥剂的临界值几种干燥剂的临界值干燥剂临界温度/摄氏度一氧化二氮氟利昂13氟利昂23液态二氧化碳、26.528.925.931.1临界压力（kg/cm2）标准

23、大气压下71.238.247.772.8第12页/共60页第十三页，共61页。临界点干燥临界点干燥临界点干燥临界点干燥(gnzo)(gnzo)法原理法原理法原理法原理在在干干燥燥过过程程中中，表表面面张张力力会会使使样样品品变变形形。因因此此，为为了了保保持持样样品品的的完完好好形形态态，必必须须消消除除表表面面张张力力造造成成的的影影响响。我我们们知知道道，液液体体表表面面张张力力随随其其温温度度的的升升高高而而急急骤骤变变小小。对对于于每每一一种种液液体体，都都有有一一个个表表面面张张力力为为零零的的温温度度，这这个个温温度度叫叫临临界界温温度度。与与临临界界温温度度对对应应的的压压力力叫

24、叫临临界界压压力力，在在临临界界温温度度和和临临界界压压力力下下使使样样品品干干燥燥的的方方法法叫叫临临界界点点干干燥燥法法。现在，国内外都有商品临界点干燥仪。现在，国内外都有商品临界点干燥仪。照照理理，含含水水样样品品可可以以直直接接进进行行临临界界点点干干燥燥。可可是是，由由于于水水的的临临界界温温度度高高达达374374，临临界界压压力力高高达达2.47102.4710Pa(218Pa(218个个大大气气压压)，这这样样高高的的温温度度和和压压力力不不仅仅会会破破坏坏样样品品的的形形态态构构造造，而而且且需需要要(xyo)(xyo)耐耐压压很很高高的的仪仪器器。解解决决这这个个问问题题的

25、的办办法法就就是是选选择择临临界界温温度度接接近近室室温温，临临界界压压力力接接近近大大气气压压的的液液体体取取代代样样品品中中的的水水，然然后后对对这这种种液液体体进进行行临临界界点点干干燥燥，使使样样品品达达到到干干燥燥的的目目的的。这这种种液液体体叫叫做做转转移移液液。对对转转移移液液的的要要求求，除除要要求求其其适适当当的的临临界界温温度度和和临临界界压压力力外外，还还应应考考虑虑其其毒毒性性、密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体密度、成本和溶剂性质等，一般常用液体CO2CO2。第13页/共60页第十四页，共61页。液态液态CO2CO2临界点干燥临界点干燥(gnzo)(gnzo)法的过

26、程法的过程样品固定后系列乙醇脱水到样品固定后系列乙醇脱水到100100。中中间间液液替替换换：因因为为样样品品要要从从脱脱水水剂剂乙乙醇醇经经中中间间液液过过渡渡(gud)(gud)到到转转移移液液。因因此此，中中间间液液既既要要和和脱脱水水剂剂互互溶溶，又又要要和和转转移移液液互互溶溶。具具体体步步骤骤是是：脱脱水水后后的的样样品品在在7070乙乙醇醇与与3030醋醋酸酸异异戊戊酯酯混混合合液液中中浸浸10102020分分钟钟，然然后后再再在在3030乙乙醇醇与与7070醋醋酸酸异异戊戊酯酯混混合合液液中中浸浸10102020分分钟钟，而而后后用用100100中中间间液液(醋酸异戊酯醋酸异戊

27、酯)浸两次，每次各浸两次，每次各10102020分钟。分钟。转转移移液液替替换换：用用CO2CO2作作转转移移液液替替换换中中间间液液的的过过程程，是是在在封封闭闭的的耐耐压压室室内内进进行行的的。用用酒酒精精或或丙丙酮酮清清洗洗临临界界点点干干燥燥器器的的进进气气管管道道和和耐耐压压室室，吹吹干干后后，反反复复1 12 2次次放放入入和和排排出出液液体体CO2CO2，然然后后在在耐耐压压室室底底部部放放数数层层滤滤纸纸，并并将将装装有有样样品品的的样样品品架架放放入入。拧拧紧紧耐耐压压室室盖盖，慢慢慢慢放放入入液液体体CO2CO2。然然后后稍稍开开排排气气阀阀，以以5L/min5L/min的

28、的流流量量排排出出耐耐压压室室原原来来的的气气体体，此此时时可可闻闻到到醋醋酸酸异异戊戊酯酯味味，待待醋醋酸异戊酯味消失后，关闭排气阀。酸异戊酯味消失后，关闭排气阀。第14页/共60页第十五页，共61页。此此时时通通过过观观察察窗窗观观察察室室内内液液体体CO2CO2应应浸浸没没样样品品(如如果果不不能能浸浸没没样样品品，说说明明耐耐压压室室温温度度高高，应应降降温温后后再再行行操操作作)，关关闭闭进进气气阀阀，停停放放约约1 12 2小小时时以以完完成成CO2CO2的的置置换换过过程程。此此时时压压力力约约为为5.615.616 66.46.46Pa(576Pa(5765Kgf/cm2)65

29、Kgf/cm2)。加加热热：用用6060温温水水或或自自动动调调温温装装置置将将耐耐压压室室加加温温，压压力力很很快快增增加加，使使压压力力维维持持在在1.111.117Pa(110Kgf/cm2)7Pa(110Kgf/cm2)左左右右。5 51010分分钟钟，CO2CO2全全部部汽汽化化，从从观观察察窗窗可可看看到到其其汽汽化化过过程程是是：液液面面上上升升界界面面模模糊糊完完 全全 混混 浊浊 透透 亮亮 无无 液液 体体。这这 时时 的的 压压 力力 约约 为为 9.39.3 6Pa 6Pa(95Kgf/cm2)(95Kgf/cm2)。排排气气：在在排排气气管管口口放放一一温温水水杯杯，

30、这这样样既既可可观观察察排排出出的的气气泡泡数数以以控控制制排排气气速速度度，又又可可避避免免排排气气管管路路产产生生干干冰冰而而造造成成堵堵塞塞。慢慢慢慢打打开开排排气气阀阀，使使压压力力缓缓慢慢下下降降，并并维维持持耐耐压压室室温温度度在在5050左左右右。排排气气速速度度不不可可太太快快，否否则则会会损损伤伤样样品品，一一般般控控制制在在1010泡泡/秒秒左左右右约约每每分分钟钟445Pa5Pa9.89.8 5Pa(55Pa(510Kgf/cm2)10Kgf/cm2)的的降降压压(jin(jin y)y)速速度度。大大约约经经一一个个多多小小时时的的排排气气后后，压压力力表表指指示示为为

31、“零零”，排排气气口口无无气气泡泡时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品。时，即可打开耐压室，取出已干燥好的样品。第15页/共60页第十六页，共61页。临界点干燥(gnzo)仪第16页/共60页第十七页，共61页。临界点干燥临界点干燥(gnzo)(gnzo)的失误和解决办法的失误和解决办法1.1.样品干燥不充分：这是最常见的问题，可能有以下几种原因：样品干燥不充分：这是最常见的问题，可能有以下几种原因：（1 1）脱脱水水不不彻彻底底，中中间间液液醋醋酸酸异异戊戊酯酯和和液液态态二二氧氧化化碳碳置置换换(zhhun)(zhhun)不良，最终导致干燥不充分。不良，最终导致干燥不充分。（2 2）醋醋

32、酸酸异异戊戊酯酯反反流流：在在冬冬季季反反复复使使用用仪仪器器，可可能能使使醋醋酸酸异异戊戊酯酯凝凝结结在在排排气气管管上上。如如果果此此时时打打开开样样品品室室盖盖，由由于于气气压压的的变变化化，会会使使排排气气管管中中的的醋醋酸酸异异戊戊酯酯反反流流，并并浸浸湿湿已已干干燥燥好好的的样样品品。解解决决的的办办法法是是沿沿样样品品室室的的内内壁壁垫垫上上一一层层滤滤纸纸，用用来来吸吸附附反反流流的的醋醋酸异戊酯。酸异戊酯。（3 3）一一次次干干燥燥的的样样品品过过多多：样样品品笼笼的的高高度度一一般般以以不不超超过过样样品品室室深深度度的的一一般般为为宜宜。否否则则样样品品过过多多，带带入入

33、的的醋醋酸酸异异戊戊酯酯也也过过多多样样品不易干燥充分。品不易干燥充分。第17页/共60页第十八页，共61页。2.2.样品室内压力达不到要求：样品室内压力达不到要求：（1 1）注注入入液液态态二二氧氧化化碳碳量量过过少少：可可能能会会使使样样品品位位于于二二氧氧化化碳碳的的气气液液面面交交界界处处，样样品品受受到到液液体体二二氧氧化化碳碳表表面面张张力力的的作作用用，尽尽管管比比水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精细结构。水的表面张力小的多，但仍会影响样品的精细结构。（2 2）样样品品室室密密闭闭不不良良：这这可可能能是是因因为为垫垫圈圈老老化化，有有裂裂纹纹(li(li wn)wn)，或垫

34、圈下有异物等。，或垫圈下有异物等。3.3.注注入入液液体体二二氧氧化化碳碳困困难难：主主要要因因为为样样品品室室的的温温度度高高，没没有有事事先先降降温温。夏夏季季室室温温高高于于3030度度时时更更易易造造成成注注入入困困难难。降降温温的的办办法法有有两两种种：一一是是用用少少许许液液体体二二氧氧化化碳碳充充盈盈2-32-3次次，再再放放掉掉气气体体的的二二氧氧化化碳；二是用控温钮调制低于室温碳；二是用控温钮调制低于室温1010度。度。第18页/共60页第十九页，共61页。6.2.4 6.2.4 冷冻干燥法冷冻干燥法在在冷冷冻冻干干燥燥过过程程中中，样样品品中中的的水水分分直直接接由由冰冰态

35、态升升华华为为气气态态，样样品品也也不不受受表表面面张张力力的的影影响响。但但这这种种方方法法也也有有不不足足之之处处，如如：样样品品中中的的水水分分易易形形成成冰冰晶晶而而破破坏坏超超微微结结构构。因因此此需需要要大大量量的的冷冷冻冻剂剂和和较较好好的的真真空空装装置置，使使造造价价提提高高。再再加加上上所所需需冷冷冻冻时时间间(shjin)(shjin)过过长长，更更限限制制了了这这种种方方法法的的使使用用。所所以以，尽尽管管用用这这种种方方法法能能较较好好地地保保存存样样品品中中的的水水溶溶性性和和脂脂溶溶性性 物物质质，但但是是使使用用仍仍不不普普遍遍。有有下下面面两两种种方法：方法：

36、第19页/共60页第二十页，共61页。一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附一直接冷冻干燥法：这种方法适用于新鲜样品。把样品粘附在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用在小铜片上后快速投入丙烷中进行冷冻固定，丙烷须用液氮预冷。固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷液氮预冷。固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷液氮预冷。固定好的样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷液氮预冷。固定好的

37、样品放入真空喷镀仪中，用液氮冷却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品却，保持一定的温度压力连续抽真空若干天，直至样品完全干燥为止。完全干燥为止。完全干燥为止。完全干燥为止。乙醇冷冻干燥法：乙醇冷冻干燥法：乙醇冷冻干燥法：乙醇冷冻干燥法：按照按照按照按照(nzho)(nzho)常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至常规方法戊二醛固定，乙醇梯度脱水至100%100%。把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使。把样品投入注满液氮的

38、冷冻干燥仪的金属杯中使。把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使。把样品投入注满液氮的冷冻干燥仪的金属杯中使样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装样品中的乙醇固化。把金属杯放入冷冻干燥仪的喷度装置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的置中，通过旋转泵抽气使液氮固化并升华，接着固化的乙醇也升华，样品随之干燥。乙醇也升华，样品随之干燥。乙醇也升华，样品随之干燥。乙醇也升华，样品随之干燥。第

39、20页/共60页第二十一页，共61页。6.3 6.3 导电导电(dodin)(dodin)大大多多数数生生物物样样品品的的表表面面电电阻阻很很高高，直直接接用用扫扫描描电电镜镜观观察察会会产产生生充充放放电电效效应应，所所以以要要对对样样品品进进行行导导电电处处理理。常常用用的的导导电电处处理理方方法有金属喷镀法和导电染色法。法有金属喷镀法和导电染色法。金金属属喷喷镀镀法法是是将将干干燥燥后后的的样样品品用用导导电电胶胶粘粘在在样样品品台台上上，放放入入真真空空喷喷镀镀仪仪内内或或离离子子溅溅射射仪仪内内喷喷约约15nm15nm厚厚的的碳碳或或金金，随随后后进进行行电电镜镜观观察察。这这种种方

40、方法法除除可可消消除除充充放放电电效效应应外外，还还可可提提高高二二次次电电子子发射率。缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形。发射率。缺点是热辐射和原子轰击会使样品变形。导导电电染染色色法法是是用用金金属属盐盐类类化化合合物物与与生生物物体体的的蛋蛋白白质质、脂脂类类、糖糖类类等等结结合合，使使表表面面离离子子化化，或或游游离离出出金金属属分分子子镶镶嵌嵌于于生生物物分分子子间间，从从而而(cng(cng r)r)使使样样品品表表面面电电阻阻值值降降低低，消消除除充充电电放放电电效效应应，同时在一定程度上起硬化组织的固定作用。同时在一定程度上起硬化组织的固定作用。第21页/共60页第二十二页，共

41、61页。6.3.1 6.3.1 金属金属(jnsh)(jnsh)镀膜法镀膜法金金属属镀镀膜膜法法就就是是把把样样品品镀镀上上一一层层很很薄薄的的并并且且非非常常均均匀匀的的金金属属膜膜（一一般般20nm20nm厚厚的的金金膜膜）。因因为为金金的的化化学学性性质质比比较较稳稳定定，不不与与样样品品中中的的化化学学成成分分反反应应，使使既既不不影影响响样样品品本本身身的的结结构构，样样品品又又有有导导电电性性。经经过过金金属属镀镀膜膜的的样样品品，能能产产生生大大量量的的二二次次电电子子从从而而提提高高图图像像的的而而质质量量。另另外外还还能能加加强强样样品品对对电电子子束束轰轰击击的的抗抗击击力

42、力，以以减减小电子束对样品的损伤。小电子束对样品的损伤。有有两两种种方方法法，一一是是离离子子(lz)(lz)溅溅射射法法，二二是是真真空空喷喷度度法。法。第22页/共60页第二十三页，共61页。在电场的作用下，使真空罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电子，它们分别飞向阴极和阳极并不断的与其它的气体分子相碰撞，表现为紫色的放电现象。此外，阳离子又可以轰击阴极上的金属靶，使部分金属原子被激发出来，这些金属原子在电场的加速作用下，可从不同的方向和角度飞向阳极呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成连续(linx)而均匀的金属膜。薄膜的厚度可以控制在1-100nm之间，这样既不掩盖样品的表面结构，又使样

43、品具有了良好的导电性。6.3.1.1离子离子(lz)溅射法原理溅射法原理第23页/共60页第二十四页，共61页。离子离子(lz)(lz)溅射仪溅射仪第24页/共60页第二十五页，共61页。1.1.因因为为飞飞散散出出来来的的金金属属颗颗粒粒为为原原子子或或分分子子很很小小，所所以以镀镀膜膜质地精细。质地精细。2.2.2.2.因因为为金金属属颗颗粒粒带带负负电电，样样品品表表面面(biomin)(biomin)带带正正电电，且且各各部部位位的的正正电电位位相相同同，使使金金属属颗颗粒粒均均匀匀的的飞飞向向带带正正电电的样品表面的样品表面(biomin)(biomin)，所以镀膜均匀。，所以镀膜均

44、匀。3.3.3.3.镀镀膜膜仪仪通通过过调调节节电电流流强强度度和和真真空空度度来来控控制制飞飞散散出出来来的的金金属属颗颗粒粒的的数数量量，从从而而有有效效的的控控制制镀镀膜膜的的厚厚度度，使使其其既既不不遮遮盖盖样样品品表表面面(biomin)(biomin)的的微微细细结结构构，又又能能具具有有良良好的导电性。好的导电性。4.4.4.4.离离子子溅溅射射时时原原子子的的能能量量大大约约为为真真空空镀镀膜膜时时原原子子能能量量的的100100倍，所以溅射镀膜的附着力强。倍，所以溅射镀膜的附着力强。离子离子离子离子(lz)(lz)溅射镀膜的特点溅射镀膜的特点溅射镀膜的特点溅射镀膜的特点第25

45、页/共60页第二十六页，共61页。6.3.1.2真空镀膜的原理真空镀膜的原理(yunl)及特点及特点在在真真空空的的条条件件下下，把把金金属属丝丝加加热热到到一一定定的的温温度度时时，该该金金属属就就会会急急剧剧地地蒸蒸发发。此此时时，如如果果把把样样品品放放在在距距金金属属丝丝5cm5cm左左右右处处，蒸蒸发发的的金金属属原原子子就就会会洒洒落落在在其其表表面面(biomin)(biomin)，使其覆盖上一层金属膜，真空镀膜仪就是根据这一原理设计的。，使其覆盖上一层金属膜，真空镀膜仪就是根据这一原理设计的。由由于于镀镀膜膜是是在在真真空空条条件件下下进进行行的的，因因此此即即可可以以防防止止

46、样样品品受受传传导导和和对对流流引引起起的的热热损伤，又可以防止样品受金属氧化引起的污染。损伤，又可以防止样品受金属氧化引起的污染。并且在镀膜的时候样品台旋转使样品表面并且在镀膜的时候样品台旋转使样品表面(biomin)(biomin)的镀膜均匀。的镀膜均匀。一般用铝和铜，比离子溅射法成本低。一般用铝和铜，比离子溅射法成本低。对对 于于 样样 品品 表表 面面(biomin)(biomin)凹凹 凸凸 明明 显显 的的，最最 好好 先先 喷喷 一一 层层 碳碳 以以 加加 固固 其其 表表 面面(biomin)(biomin)结结构构，而而离离子子溅溅射射法法不不能能喷喷碳碳，所所以以对对于于

47、这这类类有有特特殊殊要要求求的的样样品品选选用真空镀膜仪。用真空镀膜仪。第26页/共60页第二十七页，共61页。离子溅射镀膜与真空镀膜相比，其主要优点是：离子溅射镀膜与真空镀膜相比，其主要优点是：（1 1）装置结构简单，使用方便，溅射一次只需几分钟，而真空镀膜则要半个小时）装置结构简单，使用方便，溅射一次只需几分钟，而真空镀膜则要半个小时以上。以上。（2 2）消耗）消耗(xioho)(xioho)贵金属少，每次仅约几毫克。贵金属少，每次仅约几毫克。（3 3）对同一种镀膜材料，离子溅射镀膜质量好，能形成颗粒更细、更致密、更均）对同一种镀膜材料，离子溅射镀膜质量好，能形成颗粒更细、更致密、更均匀、

48、附着力更强的膜。匀、附着力更强的膜。第27页/共60页第二十八页，共61页。对对不不导导电电的的样样品品，最最好好在在样样品品加加工工完完毕毕后后，立立即即蒸蒸镀镀金金或或者者碳碳等等导电膜，镀膜后应马上分析，避免表面污染和导电膜脱落。导电膜，镀膜后应马上分析，避免表面污染和导电膜脱落。金金导导电电膜膜导导电电性性好好，二二次次电电子子发发射射率率高高，可可以以拍拍摄摄出出质质量量好好的的图图象象。如如果果成成分分定定性性、定定量量分分析析，必必须须蒸蒸镀镀碳碳导导电电膜膜。碳碳为为超超轻轻元元素素，对对所所分分析析元元素素的的X X 射射线线吸吸收收小小，对对定定量量分分析析结结果果影影响响

49、小小。蒸蒸镀镀金金可可以以用用真真空空镀镀膜膜仪仪或或离离子子溅溅射射仪仪，蒸蒸镀镀碳碳只只能能用用真真空空镀镀膜膜仪仪。镀镀膜膜要要均均匀匀，厚厚度度控控制制在在20nm 20nm 左左右右，为为了了保保证证样样品品与与标标样样镀镀膜膜厚度相同，标样和样品应该同时蒸镀。厚度相同，标样和样品应该同时蒸镀。真真空空镀镀膜膜仪仪在在蒸蒸镀镀过过程程中中会会产产生生1000C1000C2000C 2000C 的的高高温温，而而样样品品距距蒸蒸发发源源约约为为15mm 15mm 左左右右，对对熔熔点点低低的的有有机机物物样样品品、生生物物样样品品及及镶镶嵌嵌材材料料等等都都会会产产生生影影响响。必必须

50、须控控制制蒸蒸镀镀时时间间，长长时时间间镀镀膜膜不不但但温温升升影影响响样样品品，而而且且镀镀膜膜厚厚度度增增加加会会影影响响定定量量分分析析结结果果。如如果果金金膜膜太太厚厚，金金粒粒子子会会聚聚集集成成岛岛状状结结构构，在在高高倍倍图图象象观观察察时时产产生生假假象象，同同时时也也会会覆覆盖盖样样品品的的微微细细结结构构。为为了了控控制制镀镀碳碳膜膜厚厚度度，最最简简单单的的方方法法(fngf)(fngf)是是在在镀镀膜膜样样品品的的附附近近放放一一块块经经抛抛光光的的黄黄铜铜，用用黄黄铜铜表表面面镀镀膜膜后后的的干干涉涉色色判判断断膜膜厚厚，20nm20nm黄黄铜铜表表面面的的干干涉涉色