琼脂糖凝胶电泳完整整理学习教案.pptx

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1、会计学1琼脂糖凝胶电泳完整整理琼脂糖凝胶电泳完整整理第一页，编辑于星期二：三点 五十一分。分子生物学实验技术专题分子生物学实验技术专题第1页/共31页第二页，编辑于星期二：三点 五十一分。电泳技术简介电泳技术简介什么是电泳技术？电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。第2页/共31页第三页，编辑于星期二：三点 五十一分。电泳技术的分类电泳技术的分类电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带

2、电泳（有支持体）两大类。自由电泳包括Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳。区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、醋酸纤维薄膜电泳、非凝胶性支持体区带电泳（支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)、凝胶支持体区带凝胶支持体区带电泳电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。第3页/共31页第四页，编辑于星期二：三点 五十一分。凝胶电泳技术凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第4页/共31页第五页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶电泳：实验原理琼脂糖凝胶电泳：实验原理琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是

3、琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-D-半乳糖和半乳糖和3.6-3.6-脱水脱水-L-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、凝胶。其本身不带有电荷。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。第5页/共31页第六页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶电泳：实验原理琼脂糖凝胶电泳：实验原理DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动

4、。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。第6页/共31页第七页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖与琼脂的区别琼脂糖与琼脂的区别琼脂是由琼脂糖（琼脂是由琼脂糖（agaroseagarose）和琼脂果胶）和琼脂果胶（agaropectinagaropectin）组成的。琼脂糖的结构单元是）组成的。琼脂糖的结构单元是 D-D-半半乳糖和乳糖和3.6-3

5、.6-脱水脱水-L-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多更半乳糖；琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的移动产生影响。团，就会造成电内渗，电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通

6、常在0.2%0.2%以以下，电内渗比较小，通常在下，电内渗比较小，通常在0.13%0.13%以下。以下。简言之，简言之，琼脂糖是从琼脂中精细提取的琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身独，有自身独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。第7页/共31页第八页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶电泳特点琼脂糖凝胶电泳特点第8页/共31页第九页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶的配置1.根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为1TAE或0.5TBE。注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶

7、的缓冲液必须是相同的。同的。2.根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%50%容量。容量。3.在微波炉中加热溶解琼脂糖注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。微波炉中加热时间不宜过长。第9页/共31页第十页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶的配置3.3.使溶液冷却至使溶液冷却

8、至6060左右，如需要可在此时加入溴化左右，如需要可在此时加入溴化乙锭乙锭(EB)(EB)溶液使其终浓度为溶液使其终浓度为0.5ug/ml0.5ug/ml，并充分混匀，并充分混匀不提倡使用。不提倡使用。注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。5.5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在插上梳子。凝胶厚度一般在3 35mm5mm之间。之间。注意：不要产生气泡，溶液温度太高注意：不

9、要产生气泡，溶液温度太高(60(60)，会使得水分过分，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。6.6.在室温下使胶凝固（大约在室温下使胶凝固（大约3030分钟），然后放置于电分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。泳槽中进行电泳。注意：注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在4 4下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2 25 5天。天。第10页/共31页第十一页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液有几种缓冲液适用于天然双链DNA的

10、电泳Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液（pH8.0,TAE，也称为E缓冲液）Tris-硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液(TPE)第11页/共31页第十二页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液第12页/共31页第十三页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液第13页/共31页第十四页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA条带模糊或不规则DNA带迁移。电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，太

11、多则电流加大，凝胶发热。第14页/共31页第十五页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于上样操作；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰FF。第15页/共31页第十六页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；在0.5TBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约300bp的线

12、性双链DNA相同，而二甲苯氰FF约与长4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。第16页/共31页第十七页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液第17页/共31页第十八页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7第18页/共31页第十九页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7

13、DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。第19页/共31页第二十页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁移速率就越低，反之迁移速率就大。另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，

14、但分离的片段就越小。第20页/共31页第二十一页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度第21页/共31页第二十二页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。第22页/共31页第二十三页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7 低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正

15、比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5-8V/cm第23页/共31页第二十四页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7 包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。第24页/共31页第二十五页，编辑于星期二：三点 五十一分。琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度第25页/共31页第二十六页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5

16、电泳缓冲液6嵌入染料的存在7溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向;溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。第26页/共31页第二十七页，编辑于星期二：三点 五十一分。影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染料复合物在凝胶中

17、的迁移率约降低15%。第27页/共31页第二十八页，编辑于星期二：三点 五十一分。DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析问题问题原因原因解决办法解决办法DNADNA带模糊带模糊1)DNA降解避免核酸酶污染2)电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3)所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4)DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量5)DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6)有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白7)DNA变性电泳

18、前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA第28页/共31页第二十九页，编辑于星期二：三点 五十一分。DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析问题问题原因原因解决办法解决办法不规则不规则DNA带迁移带迁移1)对于/Hind III片段cos位点复性电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟2)电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液3)DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热带弱或无带弱或无DNA带带1)DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低2)DNA降解避免DNA的

19、核酸酶污染3)DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4)对于EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源第29页/共31页第三十页，编辑于星期二：三点 五十一分。DNA电泳常见问题分析电泳常见问题分析问题问题原因原因解决办法解决办法DNADNA带缺失带缺失1)小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2)分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3)DNA变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA4)DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析第30页/共31页第三十一页，编辑于星期二：三点 五十一分。