第四章蛋白质化学.pptx

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1、v许多-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具稳定构象并具有一定生物功能的大分子。一、蛋白质的定义：(华中P71)第1页/共124页二、蛋白质的分类：(华中P71)1、根据分子的形状：(P71)球状蛋白(globular protein)(globular protein)：分子似球形，较易溶解，如：血液的血红蛋白、血清蛋白 纤维蛋白(fibrous protein)(fibrous protein)：形状似纤维，不溶于水，如：指甲、羽毛中的角蛋白和蚕丝中的丝蛋白第2页/共124页2、根据组成分类：(华中P71)单纯蛋白质（简单蛋白质）：仅含-氨基酸，根据其理化性质（溶解性质），可

2、进一步分类：a 清蛋白(白蛋白）:溶于水b 球蛋白：微溶于水而溶于稀中性盐溶液c 谷蛋白：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱d 醇溶谷蛋白：不溶于水，溶于70-80%的乙醇e 精蛋白和组蛋白：溶于水及酸性液，呈碱性f 硬蛋白：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液第3页/共124页 结合蛋白：除含有-氨基酸外还含有糖、脂类、核酸、磷酸以及色素等其他成分a 核蛋白(nucleoprotein)：辅基是核酸b 色蛋白(chromoprotein)：辅基是色素c 糖蛋白（glycoprotein)：辅基为糖或糖的衍生物d 脂蛋白(lipoprotein)：与脂类结合的蛋白质e 磷蛋白(phosphop

3、rotein)：磷酸基通过酯键与蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基连相连。f 金属蛋白(metalloprotein):与金属结合第4页/共124页3、根据功能分类：(华中P72)功能蛋白（活性蛋白）：包括在生命过程中一切有活性的蛋白质及其前体。如：酶、激素蛋白质、运输蛋白质、储存蛋白质、保护或防御蛋白质、受体蛋白质、毒蛋白、控制生长和分化的蛋白质以及膜蛋白等。结构蛋白（非活性蛋白）：对生物体起保护或支持作用。如：硬蛋白（胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白）第5页/共124页三、蛋白质的生物学功能 (华中P72)1 酶（生物催化作用）2 生物体组成成分（生物有机体的结构物质）3 运输（物质的转运和

4、储存作用）。4 干扰素、抗体（免疫保护作用）。5 激素（代谢调节作用）。6 运动（运动和支持作用）。7 遗传信息的控制（生长、繁殖、遗传、变异作用）。8 细胞膜的通透性（生物膜的组成成分）。9 结缔组织的主要成分（保护结缔组织的作用）10 高等动物的记忆、识别机构。第6页/共124页举例说明蛋白质的生物学意义第7页/共124页1、生物有机体的结构物质第8页/共124页2、酶（生物催化作用）：某些蛋白质是酶，催化生物界体内的代谢反应。第9页/共124页 3、调节蛋白（代谢调节作用）:激素调节生物体内的物质代谢，而许多激素就属于蛋白质如：促甲状腺激素是糖蛋白，能促进甲状腺的发育和分泌而影响全身代谢

5、；如：胰岛素调节糖代谢,能降低血液中葡萄糖的含量,胰岛素是分子量最小的蛋白质，疾病的发生是代谢发生偏差第10页/共124页4.防御蛋白（免疫保护作用）：高等动物的免疫反应是有机体的一种防御机能，免疫反应主要是通过蛋白质来实现的。第11页/共124页5、转运蛋白（物质的转运作用）：某些蛋白质具有运输功能，他们携带小分子从一处到另一处，如：血红蛋白、膜转运蛋白。第12页/共124页6.营养和存储蛋白卵清蛋白和牛奶中的酪蛋白是提供氨基酸存储蛋白。在某些植物、细菌及动物组织中发现的铁蛋白可以贮存铁。第13页/共124页7.收缩和运动蛋白:某些蛋白质赋予细胞和器官收缩能力可使其改变形状和运动。如：肌肉、

6、微管、鞭毛、微丝等。第14页/共124页8.结构蛋白（支持作用）：某些蛋白质建造和维持生物体的结构、细胞骨架。如：角蛋白、胶原蛋白。第15页/共124页9.受体蛋白（信息传递作用）：乙酰胆碱受体蛋白乙酰胆碱酯酶破坏掉多余乙酰胆碱起接受和传递信息作用的受体也是蛋白。如：接受各种激素的受体蛋白。接受外界刺激的感觉蛋白。（视质红质，味觉蛋白。）第16页/共124页10、其它北极鱼抗冻蛋白、蛇毒、蜂毒的溶血蛋白。、海洋生物如贝类分泌的一类胶质蛋白，能将贝壳牢固粘在岩石或其它硬表面上。第17页/共124页第二节 蛋白质分子的组成成分华中P74第18页/共124页v1.组成:碳 50-55%、氢 6-8%

7、、氧 19-24%、氮13-19%、硫 0-4%。v2.各种蛋白质含氮量：平均为16%。1g氮的存在，蛋白质含量为100/166.25v3.克氏定氮法的基础：每克样品中含氮的克数6.25100 一 蛋白质的元素组成 P华中74第19页/共124页二 蛋白质的水解 v1、酸水解：（6M,HCl 或 4M H2SO4）优点：不起消旋作用 缺点：色氨酸被破坏，羟基 氨基酸部分分解，酰胺基水解。v2、碱水解（5MNaOH）优点：色氨酸稳定缺点：多数氨基酸遭到不同程度的破坏，产生混合物(引起消旋)，精氨酸脱氨第20页/共124页3、酶水解：缺点：持续时间较长，部份水解。优点：不产生消旋，也不破坏氨基酸酶

8、法主要用于部分水解,常用的酶有胰蛋白酶胰凝乳蛋白质、胃蛋白酶等。蛋白质完全水解需几种酶的作用。第21页/共124页三.蛋白质的基本结构单位氨基酸 （清华P10华中P75）（一）.氨基酸的结构:不带电形式 H2NCHCOOHR +H3NCHCOO-R两性离子形式第22页/共124页v组成蛋白质的氨基酸（称为基本氨基酸）都是氨基酸。v组成蛋白质的氨基酸都是L氨基酸。v天然存在的氨基酸多为L型。v根据R基结构可将氨基酸分类。C如是不对称C（除Gly），则：1.具有两种立体异构体 D-型和L-型 2.具有旋光性 左旋（-）或右旋（+）第23页/共124页（二）.氨基酸的分类v1、常见的蛋白质氨基酸：从

9、各种生物体发现的氨基酸有180多种，参与蛋白质组成的氨基酸有20种称为蛋白质氨基酸按R基的化学结构分为三类按极性分为四类按酸碱性质分为三类。第24页/共124页v（1）脂肪族氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His、Pro（亚氨基酸）根据R的化学结构第25页/共124页根据R的极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；（2）带正电：His、Lys、Arg；（3）带负电：Asp、Glu（4）非极性氨基酸：G

10、ly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp第26页/共124页根据酸碱性质分（1）酸性氨基酸：Asp、Glu（2）碱性氨基酸：Lys、His、Arg（3）中性氨基酸：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys、Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、第27页/共124页举例说明氨基酸的结构（按化学结构分类）第28页/共124页I、R基为脂肪族氨基酸：1）一氨基一羧基的中性氨基酸2）一氨基一羧基的极性氨基酸3）一氨基二羧基的酸性氨基酸4）二氨基一羧基的碱性氨基酸第29页/共124页1）一氨基一羧基的中性氨基酸第30页/共124页2）一

11、氨基一羧基的极性氨基酸A、含硫氨基酸半胱氨酸蛋氨酸(甲硫氨酸)第31页/共124页B、含羟基的氨基酸2）一氨基一羧基的极性氨基酸丝氨酸苏氨酸第32页/共124页 C、含酰胺基的氨基酸 天冬酰氨谷胺酰氨第33页/共124页3）二羧基一氨基氨基酸酸性氨基酸：谷氨酸天冬氨酸第34页/共124页4）二氨基一羧基碱性氨基酸赖氨酸精氨酸NH2第35页/共124页II、R基为芳香族氨基酸酪氨酸苯丙氨酸第36页/共124页III、R基为杂环氨基酸色氨酸组氨酸第37页/共124页III、R基为杂环氨基酸（杂环亚氨基酸）脯氨酸第38页/共124页v是氨基酸的一些衍生物，一般是蛋白质合成后形成，主要有：4-羟基脯氨

12、酸5-羟基赖氨酸6-N-甲基赖氨酸-羧基谷氨酸锁链素2、不常见的蛋白质氨基酸（稀有氨基酸）：第39页/共124页 4-羟脯氨酸（4-hydroxylysine)第40页/共124页第41页/共124页第42页/共124页四、氨基酸的重要理化性质 清华P16华中P801 一般物理性质 无色晶体，熔点极高（200以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂，除甘氨酸以外都有旋光性。第43页/共124页2 两性解离和等电点 清华P16华中P81 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-NH3+正离子和能接受质子的-COO-负离子，

13、为两性电解质。第44页/共124页调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的+NH3基和COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。H3NCHCOOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pHpI）H3NCHCOO-R+在晶体状态或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2NCHCOO-R在碱性溶液中的氨基酸（pHpI）（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的-氨基，-羧基是可以离子化的)。第45页/共124页2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pI=pK1+pK22氨基酸等电点的确定：1）酸

14、碱滴定（滴定曲线）pI=pK2+pK32or第46页/共124页第47页/共124页24681012140.51.01.52.0OH-加入的当量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly的滴定曲线OH-OH-+H3NCCOOHHH（1）+H3NCCOO-HH（2）H2NCCOO-HH（3）Gly解离作用第48页/共124页3 氨基酸的化学反应1）、与亚硝酸的反应：可生成氮气(Van Slyke法测氨基酸的基础）:氨基酸的氨上氢可以被酰基取代，取代基对于氨基有保护作用。I.-氨基参加的反应 清华P20华中P84RCHCOOHNH3+RCHCOOHOH+N2+H2OHNO2+第49页/共124页

15、2)与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法的基础RCHCOO-NH3+RCHCOO-NH2+H+OH-中和滴定HCHORCHCOO-NHCH2OHHCHORCHCOO-N(CH2OH)2羟甲基AA二羟甲基AA见华中P84氨基酸的甲醛滴定第50页/共124页3）、烃基化反应：清华P21华中P85a.2、4-二硝基氟苯，DNFB可生成二硝基苯基氨基酸(黄色)。b.苯异硫氰酸酯：PITC生成PTH-AA Edman降解法原理，在多肽蛋白质氨基末端测定和氨基酸顺序分析中占有重要地位第51页/共124页与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应NO2FO2N+HNCHCOOHRNO2O2NHNCHCOOHR+HF

16、弱碱性DNP-氨基酸第52页/共124页与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 N=C=S +NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”第53页/共124页4）、与酰化试剂的反应（华中P85）通式：实例：第54页/共124页H2NCHCOOH RNCH3CH3O=S=Cl5-二甲氨基萘磺酰（DNS-Cl）pH9.7 40NCH3CH3O=S=HNCHCOOH RDNS-氨基酸（有荧光）取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高O氯+酰化反应另例：(清华P21/华中

17、P86提到的丹磺酰氯)O第55页/共124页5 5）与醛类的反应：清华P21P21华中P86P86氨基与醛类反应形成西夫（schiffschiff）碱 （前面的甲醛反应是特例）第56页/共124页6 6）脱氨基反应 华中P86P86AAAA在体内经氧化剂或氧化酶脱去氨基变成酮酸。是生物体内AAAA分解代谢的重要方式之一：第57页/共124页1)、成盐：羧基与碱作用成盐II-II-羧基参加的反应：清华P20华中P86第58页/共124页2 2）成酯反应 氨基酸在盐酸气体的条件下与无水乙醇作用即产生氨基酸的乙酯。羧基变成甲酯、乙酯、成盐后羧基的化学性质即能被掩盖（羧基保护）。而氨基被活化，容易与酰

18、基或烃基反应。第59页/共124页氨基酸的氨基加保护基以后，其羧基可以与二氯亚砜或五氧化二磷成酰氯。这个反应使羧基活化，使它容易与另一氨基酸的氨基结合，是人工合成多肽种常用的反应。3)3)、成酰氯（酰化）反应 第60页/共124页4)4)、叠氮反应：氨基酸的氨基通过酰化加以保护，羧基经酯化变成甲酯，然后与肼和亚硝酸反应变成叠氮化合物（羧基活化反应）。第61页/共124页5)5)、脱羧基作用 氨基酸经脱羧酶作用后可以放出二氧化碳生成相应的一级胺，体外弱碱加热进行此反应：第62页/共124页-氨基和-羧基共同参加的反应：华中P861）形成肽键：一个AA的氨基与另一个AA的羧基可缩合成肽，其键称为肽

19、键：特例：第63页/共124页生成蓝紫色物质（有氨气放出）。茚三酮反应是纸层析、柱层析常用的定量测定方法。羟脯氨酸和脯氨酸（不释放氨气）生成黄色化合物。Gln、Asn生成棕色化合物。2)2)、与茚三酮反应：清华P21P21华中P86P86黄色化合物第64页/共124页 侧链R基产生的反应 清华P21华中P87 侧链功能团也能发生化学反应，苯环苯丙氨酸、酪氨酸，酚基酪氨酸羟基丝氨酸、苏氨酸，巯基半胱氨酸，（-SS-胱氨酸）吲哚基色氨酸，胍基精氨酸，咪唑基组氨酸。第65页/共124页例1）酚基的反应酚基有Millon反应：与HgNO3、Hg（NO3）2和HNO3反应，呈红色；Folin反应：酚基可

20、还原磷钼酸、磷钨酸生成蓝色物质。以上反应用于鉴定酪氨酸，作蛋白质定性试验。第66页/共124页酪氨酸的酚基使3和5位上易发生亲电取代反应：酪氨酸的Pauly反应：橘黄色物质第67页/共124页5）苯基的反应酚基和苯环都有黄色反应：与HNO3作用成黄色物质，用于鉴定苯丙氨酸和酪氨酸，但需要用别的反应区别酪氨酸和苯丙氨酸第68页/共124页例例2）-SH以及以及-SS-的反应的反应-SH是还原剂，活泼，可与苯甲酰氯（苄氯）、苄氧酰氯、碘乙酰胺等结合：第69页/共124页过甲酸可定量打开胱氨酸的-S-SS-S-键（氧化过程）；还原剂巯基乙醇也可以打开二硫键，生成半胱氨酸（还原过程）第70页/共124

21、页-OH的反应的反应丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、酪氨酸的-OH可与酸结合成酯，蛋白质中的丝氨酸常与磷酸结合：第71页/共124页咪唑基的反应组氨酸的咪唑基上的-NH-位可与磷酸或三苯甲基结合：组氨酸的Pauly反应：（棕红色）第72页/共124页吲哚基的反应色氨酸的吲哚基可与乙醛酸或二甲基氨甲醛（Ehrlich)反应，成紫红色化合物；能还原磷钼酸、磷钨酸成钼蓝、钨蓝；被N-溴代琥珀酰亚胺氧化：第73页/共124页胍基的反应坂口反应：碱性溶液中与含有-萘酚及次氯酸钠的物质生成红色物质；与环己二酮反应：与硝酸反应：第74页/共124页甲硫基的反应 甲硫基是一个很强的亲核基团，与烃化试剂形成锍盐（su

22、lfonium)第75页/共124页第 三 节 肽peptideP87第76页/共124页一.定义：一个氨基酸的-羧基和另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而成的化合物称之为肽。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。第77页/共124页二、肽和肽键的结构（一）肽含有两个氨基酸的称二肽，三个氨基酸的称三肽。以此类推。参加多肽形成的已不是完整的氨基酸分子称氨基酸残基。第78页/共124页 当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽和多肽。多肽仍然有游离的-氨基和-羧基。少于10AA成为寡肽，多

23、于10AA称为多肽。分子量大于10000d称为蛋白质，小于10000d称为多肽。第79页/共124页一条多肽链通常在一端含有游离的未端氨基称之为N端，另端含有的羧基称C端。肽的命名是根据参与氨基酸残基来确定 的。从 N端 开 始 称 某 氨 酰 某 氨 酰某氨酸第80页/共124页（二）肽键（二）肽键肽键具有部分双键的性质。结构a：C-N单键可以自由转动；结构b：C=N双键不能转动，处于同一平面；结构c：键长介于以上二者结构之间。肽平面：6个原子处于同一平面。0.132nm第81页/共124页肽 键l肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有 明显的共轭作用。l组成肽键的原子处于同一平面。第82

24、页/共124页肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。第83页/共124页脯氨酸特殊，可以是顺式或者反式，这脯氨酸特殊，可以是顺式或者反式，这种肽键比较灵活，这一点在三维构象中种肽键比较灵活，这一点在三维构象中有独特的作用。有独特的作用。第84页/共124页总结肽键结构有以下几个特点：主链是重复的排列肽键具有双键的性质决定了六个原子位于同一平面即肽平面。肽平面内，两个 碳原子处于反式结构第85页/共124页、物理性质：短肽是离子晶格，水中是偶极离子存在,有一定的旋光性。、酸碱性：决定于游离末端氨基、羧基及侧链可解离的基团。三、肽的物理和化学性质第86页/

25、共124页3、化学性质除AA残基侧链基团的反应以外，其特征反应是双缩脲反应，氨基酸没有此反应。含有两个或两个以上肽键的化合物加上硫酸铜的碱性溶液形成紫色复合物。紫色复合物第87页/共124页在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。四、天然活性肽第88页/共124页1、谷胱甘肽2、剧毒物质：鹅膏蕈碱、蝎毒素、蛇毒素3、激素类：催产素、加压素、舒缓激肽、脑啡肽、睡眠肽等。4、抗生素：短杆菌肽、粘菌素、放线菌素第89页/共124页谷胱甘肽（GSH）的化学结构H2N-CHCH2CH2COCOO

26、H-GluNHCHCOCH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和其他红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态。还原型氧化型还原型GSH第90页/共124页剧毒物质鹅膏蕈碱的化学结构剧毒物质鹅膏蕈碱的化学结构第91页/共124页蛋白质的一级结构第四节P91第92页/共124页 蛋白质不是一条简单的多肽，是蛋白质不是一条简单的多肽，是一条或一条以上的多肽链按各自一条或一条以上的多肽链按各自特殊方式组合成具有完整生物活特殊方式组合成具有完整生物活性的分子。性的分子。化学概念：蛋白质中以肽键连接而成的肽链中氨基酸的排列顺序。第93页/

27、共124页一、蛋白质分子中的化学键 P1061）肽键：特殊的共价键，键长0.132 nm，维持蛋白质一级结构的主要化学键。2）二硫键：比较稳定的共价键，2个半胱氨酸的巯基之间形成键长0.40.9nm。稳定肽链空间结构的作用。3）酯键：Thr、Ser的羟基与氨基酸的羧基缩合成酯，生成酯键。4）离子键：相反电荷的吸引力。第94页/共124页5）配位键：2个原子间形成的共价键。6）氢键：氢原子与2个电负性强的原子相结合而形成。7）范德华作用力：一种弱的非专一性的吸引力。8）疏水作用：疏水基团为避开水相而相互靠近的的一种作用力。第95页/共124页Sanger 1953年完成了牛胰岛素的全部化学结构测

28、定。二链通过链间二硫键连接，链上含有链内二硫键。不同种属来源的胰岛素只是A8、A9、A10、B30有差异。二、蛋白质一级结构 举例胰岛素P92第96页/共124页胰岛素原的激活第97页/共124页第98页/共124页第99页/共124页要求蛋白质样品均一，纯度97%97%以上，须知道其相对分子量，允许误差1010左右。、测定蛋白质分子中多肽链的数目。、拆分蛋白质分子的多肽链。、测定氨基酸的组成：完全水解，计算出氨基酸成分比。三、蛋白质一级结构的测定 P93（一）、蛋白质的测序策略第100页/共124页4 4、分析多肽链的N-N-末端和C-C-末端5 5、断裂多肽链中的二硫键6 6、部份水解：用

29、两种或几种不同的断裂方式断裂成几套肽段，并使之分离 7 7、测定各肽段的氨基酸顺序、片段重叠法确定各肽段的顺序、二硫键位置的确定。第101页/共124页蛋白质的测序步骤图解第102页/共124页（二）氨基酸N-N-末端和C-C-末端的氨基酸残基的测定1 1、N-N-未端分析：1 1）二硝基氟苯法（DNFBDNFB或FDNBFDNB）原理：多肽N-N-未端氨基酸与DNFBDNFB反应生成DNP-DNP-多肽，DNP-DNP-多肽经酸完全水解后，得到混合氨基酸；只有-DNP-AA-DNP-AA可被有机溶剂抽提（如乙酸乙酯）；定量测定（纸层析、薄层层析或HPLCHPLC）。第103页/共124页多肽

30、N-N-未端氨基酸与PITCPITC反应生成PTC-PTC-多肽；在酸性条件下N-N-末端PTC-PTC-氨基酸环化并释放生成 PTHPTH氨基酸,PTH-AA,PTH-AA 用乙酸乙酯抽提后，用纸层析或薄层层析定量。除去N-N-末端氨基酸的多肽链仍是完整的，反应只使第一个肽键稳定性降低。所以剩余的多肽链可以继续使用。蛋白质序列测定仪的原理EdmanEdman降解2）苯异硫氰酸酯(PITC)法：第104页/共124页原理同上特点：有强烈荧光，紫外灯下呈蓝色光，比二硝基氟苯法灵敏倍100100倍，水解后不经抽提直接走纸电泳或层析加以鉴定。3）二甲基氨基萘磺酰氯法(DNS)：第105页/共124页

31、4 4）氨肽酶法：理论上从N-N-端逐个切下氨基酸，实际应用很难判断氨基酸释放的先后。如遇到 N N端 是环化可将环化端裂解后再测序如焦谷氨酸可由焦谷氨酸氨肽酶裂解。第106页/共124页1 1）肼解法：最常用的方法多肽中的氨基酸与肼反应生成氨基酸酰肼但C-C-端氨基酸不参加反应氨基酸酰肼与苯甲醛生成二苯基衍生物沉淀，上清液C-C-端游离的氨基酸借助于或进行层析鉴定缺点：肼解过程中谷氨酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸被破坏，精氨酸变成鸟氨酸2、C-末端测定：第107页/共124页肼解法图示第108页/共124页2 2）还原法：C-C-末端氨基酸硼氢化钠还原成相应的氨基醇；完全水解后，肽段C-C-端氨基

32、醇用层析法鉴定第109页/共124页3 3）羧肽酶法：从C-C-端逐个降解氨基酸，被释放的氨基酸的数目的种类随反应时间而变化。第110页/共124页根据释放的氨基酸量与反应时间的关系可知道 C C末端氨基酸序列羧肽酶有四种：A A、B B、C C、Y Y A A、B B分别来自于牛胰和猪胰，得自柑橘叶，取自面包酵母。A A：能释放出除脯氨酸、赖氨酸、精氨酸之外的所有C-C-端氨基酸。B B：只水解精氨酸、赖氨酸末端肽键Y Y：可作用任何一个 C C末端残基。第111页/共124页如果蛋白质含几条多肽链，其间借非共价键结合，则用尿素、胍类试剂使蛋白质变性，多肽链变成无规则构象。如果几条链通过二硫

33、键交联或存在链内二硫键，则必须打开二硫键，通常采用氧化还原的方法。通过共价二硫键结合起来肽链，如胰岛素等须断裂二硫键。（三）二硫键的断裂和多肽链的分离：第112页/共124页1 1、二硫键用巯基乙醇还原，加烷化剂如碘乙酸保护巯基，防止重新氧化。2 2、过甲酸处理。二硫键断开后形成的单个肽链，可用纸层析、离子交换层析、电泳等方法分离 。打开二硫键后的处理方法第113页/共124页（四）肽链的部分裂解和肽段 混合物的分离目前用于序列分析的方法能测定的序列都不太长，最常用、最有效的EdmanEdman降解法一次只能连续降解几十个残基，而天然蛋白质分子多在100100残基以上，因此必须把多肽裂解成较小

34、的肽段，然后再测序。第114页/共124页1 1、酶裂解法第115页/共124页木瓜蛋白酶：专一性差，断裂赖氨酸、精氨酸羧端参加的肽键葡萄球菌蛋白酶（谷氨酸酶）、梭菌蛋白酶（精氨酸酶）：高度专一第116页/共124页2 2、化学裂解法：1 1）溴化氰：只断裂蛋氨酸羧基端参与的肽键，产生的肽段不多。2 2）羟胺：专一断裂-Asn-Gly-Asn-Gly-，部分断裂snsneueu、AsnAsnAlaAla肽段的分离纯化：多肽链用上述方法断裂后，所得肽段混合物多用凝胶过滤，凝胶电泳和高效液相色谱等方法进行分离纯化。第117页/共124页1 1、Edman Edman 化学降解法苯异硫氰酸酯与多肽氨

35、基作用分三部分进行：偶联反应；环化反应；转化反应；有强烈光吸收，可用于层析鉴定。（五）肽段的氨基酸序列测定第118页/共124页不难看出每次反应只切下一个氨基酸残基，如此循环和依次切下氨基酸残基。第119页/共124页实际上分析是常把肽链的羧基端与不溶性的树脂偶联，每轮反应后只要通过过滤即可回收剩余的肽链，以利于反应循环进行。此法麻烦，工作量大。蛋白质自动测定仪出现测速加快，且灵敏度高，原理是EdmanEdman降解法 。第120页/共124页2 2、酶解法外肽酶:氨肽酶、羧肽酶，只能测定N N、C C末端几个氨基酸残基3 3、质谱法没有广泛应用，限于一些较短序列4 4、根据核苷酸序列测定法这种方法是根据蛋白质的氨基酸次序是由核酸的核苷酸序列来决定的原理设计的。根据核苷酸次序反推氨基酸序列。第121页/共124页由于一种酶切位点都在两个以上，因此除两端作用位置外，中间肽段序列无法确定。为此必须用两种或两种以上的方法断裂多肽样品，得到两套或几套肽段。不同的断裂方法切口彼此错位，两套肽段正好互跨切口重叠，这种跨切口而重叠的肽称重叠肽。借助重叠肽可确定肽段在原肽链中的位置，得出完整的氨基酸次序。（六）肽段在多肽中次序决定第122页/共124页第123页/共124页感谢您的观看！第124页/共124页