生物制药工艺学基因工程制药1.pptx

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1、会计学1生物制药工艺学生物制药工艺学 基因工程基因工程(jyn gngchng)制药制药1第一页，共41页。第一节第一节 概概述述(i sh)基因工程的概念基因工程的概念 基因工程又称为重组基因工程又称为重组DNADNA技术或基因克隆技术技术或基因克隆技术,在在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重中提取或人工合成目的基因，令其与载体构建成重组组DNADNA，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达，再转移到受体细胞，目的基因在细胞中表达得到期望的由这个外源基因所编码得到期望的由这个外源基因所编码(bi

2、n m)(bin m)的蛋白的蛋白质质,获得新的遗传性状获得新的遗传性状 。第1页/共41页第二页，共41页。基基因因工工程程(jyn gngchng)的的诞诞生生打打破破了了物物种种的的界界限限，实实现现了了物物种种间间的的基基因因交交流流，在在实实验验室室里里对对生生物物直直接接进进行行改改造造，为为生生命命科科学学的的研研究究开开辟辟了了新新的的领领域域、注注入入了了新新的的方方法法，为为提提高高人人类类的的生生活活质质量量和和健健康康水水平平开开辟辟了了新新的的途途径径，在在农农业业、工工业业、医医药药等等领领域域有有巨巨大的应用前景。大的应用前景。第2页/共41页第三页，共41页。n

3、 n基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新基因工程是生物技术的核心，基因工程技术的成就之一是用于生物治疗的新型药物的研制。型药物的研制。n n世界世界(shji)(shji)上第一个基因工程产品上第一个基因工程产品人胰岛素（美国，人胰岛素（美国，19821982年）年）n n中国第一个基因工程药物中国第一个基因工程药物1b1b干扰素（干扰素（19971997年）年）n n美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物药物研发榜首。第3页/共41页第四页，共41页。为什么选择为什么选择(xunz)基因工程基因工程l l传

4、统制药存在的问题：传统制药存在的问题：传统制药存在的问题：传统制药存在的问题：l l A.A.材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；l l B.B.内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不内源生理活性物质，或造价太高，令人望而却步，或来源困难而供不应求；应求；应求；应求；l l C.C.由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制

5、；由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制；由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制；由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制；l l D.D.提取中难免感染，后果严重。提取中难免感染，后果严重。提取中难免感染，后果严重。提取中难免感染，后果严重。l l 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以(nny(nny)大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。大量获取的生物活性物质，

6、甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。第4页/共41页第五页，共41页。生化提取生化提取 基因工程表达基因工程表达(biod)人生长激素（侏儒症）人生长激素（侏儒症）成本(chngbn)高产量低质量难以保证成本低产量(chnling)高活性强性质优 50具新鲜尸体脑下垂体中提取 基因工程1-2升细菌培养液第5页/共41页第六页，共41页。基因工程药物在解决癌症、病毒性疾基因工程药物在解决癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等方面病、心血管疾病和内分泌疾病等方面取

7、得明显的效果，为上述疾病的治疗、取得明显的效果，为上述疾病的治疗、预防和诊断预防和诊断(zhndun)提供了新型药提供了新型药物、新型疫苗和新型诊断物、新型疫苗和新型诊断(zhndun)试剂。试剂。第6页/共41页第七页，共41页。基因工程技术可生产的药物和制剂基因工程技术可生产的药物和制剂基因工程技术可生产的药物和制剂基因工程技术可生产的药物和制剂(zhj)(zhj)(zhj)(zhj)包包包包括：括：括：括：n n免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；n n细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子、凝血因子；n n激素，如胰岛素、生长激素、心素纳；n n酶类，如尿激

8、酶、链激酶、葡激酶、组织(zzh)型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。第7页/共41页第八页，共41页。基因工程技术基因工程技术(jsh)生生产药品的优点：产药品的优点：n n a.a.可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质；n n b.b.可以提供足够可以提供足够可以提供足够可以提供足够(zgu)(zgu)数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进数量的生理

9、活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；n nc.c.利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；n nd.d.内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工内源性生理活性物质

10、在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造；程和蛋白质工程进行改造；程和蛋白质工程进行改造；程和蛋白质工程进行改造；n ne.e.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选 源。源。源。源。第8页/共41页第九页，共41页。关于关于(guny)中国中国n n2020世世纪纪7070主主末末，开开始始应应用用DNADNA重重组组技技术术、淋淋巴巴细细胞胞杂杂交交瘤瘤技

11、技术术、细胞培养、克隆表达等技术开发新产品细胞培养、克隆表达等技术开发新产品 改造传统制药工艺。改造传统制药工艺。n n“863”“863”高高技技术术计计划划在在生生物物技技术术领领域域研研究究的的三三个个主主题题(zh(zh t)t)之之一一是是：新新型型药药物物、疫疫苗苗和和基基因因治治疗疗，重重点点是是利利用用现现代代生生物物技技术术手手段段，开开发发化学合成法难以生产的药品。化学合成法难以生产的药品。n n我国基因工程药物主要集中在仿制上。我国基因工程药物主要集中在仿制上。n n下游技术落后于上游技术下游技术落后于上游技术第9页/共41页第十页，共41页。第二节第二节 基因工程药物基

12、因工程药物(yow)生生 产过程产过程第10页/共41页第十一页，共41页。基因工程技术是将重组对象的目的基因基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌构建成工程菌(或细胞），实现遗传物或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制内进行复制(fzh)(fzh)和表达的技术和表达的技术第11页/共41页第十二页，共41页。基因工程药物基因工程药物(yow)制制造的主要步骤造的主要步骤n n目的基因(jyn)的克隆n n构建DNA重组体n n构建工程菌n n目的基因(jyn

13、)的表达n n外源基因(jyn)表达产物的分离纯化n n产品的检验第12页/共41页第十三页，共41页。制备制备(zhbi)基因工程药物的基基因工程药物的基本过程本过程获得目的(md)基因组建(z jin)重建质粒构建基因工程菌培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装第13页/共41页第十四页，共41页。基因工程(jyn gngchng)的上游和下游目的(md)基因载体(zit)重组DNA分子重组DNA进入宿主细胞转化/转染工程菌大规模培养表达产物分离纯化诱导上游下游实验室工厂化、产业化、商口化第14页/共41页第十五页，共41页。基因工程(jyn gngchng)重组菌构建示意图

14、第15页/共41页第十六页，共41页。n n上游上游(shngyu)(shngyu)阶段：阶段：n n 主要是分离目的基因、构建工程菌主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞细胞)。目的基。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验此阶段的工作主要在实验室内完成。室内完成。n n下游阶段：下游阶段：n n 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量从工程菌的大量培养一直

15、到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。基因工程药物生产的上游基因工程药物生产的上游(shngyu)和下游和下游第16页/共41页第十七页，共41页。

16、第三节第三节 目的目的(md)基因的获基因的获得得克隆基因的常用方法(fngf)：基因组文库法（原核）反转录法（真核）PCR法（原核+真核）反转录-聚合酶链反应法（真核）化学合成法（原核+真核）旧基因改造法（原核+真核）第17页/共41页第十八页，共41页。一一 构建基因组文库构建基因组文库(wnk)分离分离目的基因目的基因 基因组基因组基因组基因组DNADNA（genomic DNAgenomic DNA）：指代表一个细胞或生物体整套遗传信）：指代表一个细胞或生物体整套遗传信）：指代表一个细胞或生物体整套遗传信）：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体及线粒体）的所有息（染色体及线粒体）

17、的所有息（染色体及线粒体）的所有息（染色体及线粒体）的所有DNADNA序列。序列。序列。序列。基因组文库：将某种细胞的基因组基因组文库：将某种细胞的基因组基因组文库：将某种细胞的基因组基因组文库：将某种细胞的基因组DNADNA切成一定切成一定切成一定切成一定(ydng)(ydng)大小的片段，大小的片段，大小的片段，大小的片段，并与适当的载体重组后导入宿主细胞，这种含有整个基因组并与适当的载体重组后导入宿主细胞，这种含有整个基因组并与适当的载体重组后导入宿主细胞，这种含有整个基因组并与适当的载体重组后导入宿主细胞，这种含有整个基因组DNADNA信信信信息的集合。息的集合。息的集合。息的集合。第

18、18页/共41页第十九页，共41页。基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库(wnk)(wnk)（DNADNA文库文库文库文库(wnk)(wnk)）构建流程构建流程构建流程构建流程 分离基因组分离基因组分离基因组分离基因组DNADNA 限制酶限制酶限制酶限制酶 大小不同酶切片段大小不同酶切片段大小不同酶切片段大小不同酶切片段 片段酶切、回收、纯化片段酶切、回收、纯化片段酶切、回收、纯化片段酶切、回收、纯化(chn hu)(chn hu)分别与适当的载体连接分别与适当的载体连接分别与适当的载体连接分别与适当的载体连接 载体载体载体载体 DNA DNA连接酶连接酶连接酶连接酶 导入细胞导入细胞导入

19、细胞导入细胞 转化或转染转化或转染转化或转染转化或转染 克隆克隆克隆克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑繁殖成菌落或嗜菌斑繁殖成菌落或嗜菌斑繁殖成菌落或嗜菌斑 鉴定鉴定鉴定鉴定 分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定 筛选(shixun)根据基因决定筛选策略第19页/共41页第二十页，共41页。基因组文库法只适合原核基因的获得基因组文库法只适合原核基因的获得(hud)，不适用于真核基因。，不适用于真核基因。Notice:Why?第20页/共41页第二十一页，共41页。原核原核(yun h)基因与真核基因的基因与真核基因的区别区别n

20、n真核基因有内含子n n真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小一部分，为其10-5-10-7，即使多拷贝基因也只有(zhyu)10-5，因此从染色体中直接分离纯化目的基因极其困难真核基因的反转录(zhun l)克隆法第21页/共41页第二十二页，共41页。二二 反转录反转录(zhun l)法法n n从真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成与该mRNA互补的DNA（cDNA第一链），再以 cDNA第一链为模板，最终合成双链DNA序列。n ncDNA不含内含子。n n获得(hud)cDNA文库。第22页/共41页第二十三页，共41页。反转录合成反转录合成(hchng

21、)(hchng)基因的步基因的步骤：骤：mRNA mRNA的纯化的纯化 cDNA cDNA第一链的合成第一链的合成 cDNA cDNA第二链的合成第二链的合成 cDNA cDNA的克隆的克隆 将重组将重组(zhn z)(zhn z)体导体导入宿主细胞入宿主细胞 cDNA cDNA文库的鉴定文库的鉴定 目的目的cDNAcDNA克隆的分离和克隆的分离和鉴定鉴定第23页/共41页第二十四页，共41页。cDNA克隆克隆(k ln)示意示意图图mRNA逆转录酶ss-DNA逆转录酶ds-cDNAds-cDNARNaseH酶解除(jich)去mRNADNA聚合酶I核酸酶S1第24页/共41页第二十五页，共4

22、1页。1.mRNA的纯化的纯化(chn hu)n n细胞内含有3种以上的RNA，mRNA占细胞内总RNA总量的2%5%，n n真核细胞中mRNA的3-末端含有一多聚腺苷酸polyA组成的末端，足以吸附于寡聚脱氧(tu yng)胸苷酸Oligo(dt)-纤维柱上，可用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。第25页/共41页第二十六页，共41页。2.cDNA第一第一(dy)链的合成链的合成n n可用寡聚脱氧胸苷酸（可用寡聚脱氧胸苷酸（dtdt）作为引物，在反转录酶作用下，开始）作为引物，在反转录酶作用下，开始cDNAcDNA链的合成。链的合成。n n3.cDNA3.cDNA第二链的合成第二

23、链的合成n n除去除去cDNA-mRNAcDNA-mRNA杂合链中的杂合链中的mRNAmRNA链（碱解或链（碱解或RNaseHRNaseH酶解）酶解）n n然后以然后以cDNAcDNA第一链为模板开始合成第一链为模板开始合成cDNAcDNA第二链。由于第一链第二链。由于第一链cDNA3-cDNA3-末端会形成发夹结构，所以末端会形成发夹结构，所以(su(su y y)可从这点开始合成第二可从这点开始合成第二链（链（KlenowKlenow酶或酶或DNADNA聚合酶聚合酶I I）n n切除发夹结构（核酸酶切除发夹结构（核酸酶S1S1，专一性切除单链，专一性切除单链DNADNA）第26页/共41页

24、第二十七页，共41页。4.cDNA克隆克隆(k ln)n n用于cDNA克隆的载体有两类：n n 质粒DNA（如pUC、pBR322等）10kbn n根据重组后插入(ch r)的cDNA能否表达、转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为：n n 表达型载体（pUC、gt11）有启动子n n 非表达型载体（pBR322、gt10）第27页/共41页第二十八页，共41页。5.将重组将重组(zhn z)体导入宿主细胞体导入宿主细胞n n以转化以转化(zhu(zhu nhu)nhu)或转染的方向使重组或转染的方向使重组DNADNA进入宿主细胞。进入宿主细胞。n n6.cDNA6.cDNA文库的鉴定文库的鉴定

25、n n目的：评价库的好坏目的：评价库的好坏n n表型改变表型改变n n 抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变n n结构特征结构特征n n 凝胶电泳、分子杂交、凝胶电泳、分子杂交、DNADNA序列分析序列分析第28页/共41页第二十九页，共41页。7.目的目的cDNA克隆的分离克隆的分离(fnl)和和鉴定鉴定n n核酸探针杂交法核酸探针杂交法n n 根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，众单链寡核苷酸作为探针，众cDNAcDNA文库中分离特异文库中分离特异的的cDNAcDNA克隆。克隆。n n免疫

26、反应鉴定法免疫反应鉴定法n n 用表达用表达(bi(bi od)od)型载体构建的型载体构建的cDNAcDNA文库，可用文库，可用免疫学方法逐一鉴定各免疫学方法逐一鉴定各cDNAcDNA的表达的表达(bi(bi od)od)产物，产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的即以某种蛋白质的抗体寻找相应的cDNAcDNA克隆。克隆。第29页/共41页第三十页，共41页。三三 PCR法直接法直接(zhji)克隆基因克隆基因n nPCR-多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction)n nPCR是一种模拟天然DNA复制过程，在有DNA模板、DNA聚合酶、引物和四种dNTP的情况下，通过

27、高温变性（90-95)退火(tu hu)，延伸这样反复循环的过程，在体外扩增特异性DNA片段的分子生物学技术。n n可从基因组中、载体上扩增基因第30页/共41页第三十一页，共41页。PCR的条件的条件(tiojin)n n模板(mbn)双链DNAn n引物 n ndNTP 原材料：A、T、G、Cn nDNA聚合酶 链的延伸第31页/共41页第三十二页，共41页。PCR三步曲三步曲n nPCR PCR 反应分三步完成：反应分三步完成：第一步第一步 变性变性-95-95高温下，双链高温下，双链DNA DNA 变性成为单链。变性成为单链。第二步第二步 退火退火-适当温度适当温度(wnd)(wnd)

28、下，引物下，引物 DNA DNA结合在适于配对的结合在适于配对的DNADNA片片断上。断上。第三步第三步 延伸延伸-72-72，由，由DNA DNA 聚合酶催化，从引物开始利用四种脱氧核聚合酶催化，从引物开始利用四种脱氧核糖核苷酸合成目的基因糖核苷酸合成目的基因DNADNA。第32页/共41页第三十三页，共41页。PCR原理(yunl)示意图第33页/共41页第三十四页，共41页。第34页/共41页第三十五页，共41页。四四 反转录反转录(zhun l)-聚合酶链反聚合酶链反应法应法 反转录(zhun l)与聚合酶链反应（PCR）结合的方法：mRNA经反转录(zhun l)合成cDNA第一链后

29、，不再合成cDNA第二链，而是在特异引物协助下，用PCR方法进行扩增，特异地合成目的cDNA链。第35页/共41页第三十六页，共41页。五五 化学合成法化学合成法n n较较小小的的蛋蛋白白质质和和多多肽肽的的编编码码基基因因可可以以用用人人工工(rngng)(rngng)化化学学合合成成法法获获得得。化化学学合合成成法法有有个个先先决决条条件件是是：必必须须知知道道目目的的基基因因的的核核苷苷酸酸序序列列或或目目的的蛋蛋白白质质的的氨基酸序列，再按相应的密码子推导出氨基酸序列，再按相应的密码子推导出DNADNA的碱基系列。的碱基系列。n n方方法法：合合成成目目的的基基因因DNADNA不不同同

30、部部位位的的两两条条链链的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段，再再退退火火成成为为两两端端形形成成粘粘性性末末端端的的DNADNA双双链链片片段段，然然后后将将这这些些双双链链片片段段按按正正确确的的次次序序进进行行退火连接成较长的退火连接成较长的DNADNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。片段，再用连接酶连接成完整的基因。设计设计合成合成(hchng)纯纯化化组装组装第36页/共41页第三十七页，共41页。化学合成基因化学合成基因(jyn)的限制：的限制：n n不能合成太长的基因。最长50-60 bp，只适用于克隆小分子肽的基因。n n人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，

31、如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性(zhngxng)突变。n n费用太高。第37页/共41页第三十八页，共41页。六六 对旧基因对旧基因(jyn)的改造的改造 n n蛋白质工程：蛋白质工程：n n 通过对基因功能相关区域的通过对基因功能相关区域的研究，采用基因修饰技术和点研究，采用基因修饰技术和点突变技术进行基因新功能研究突变技术进行基因新功能研究和再确认，从而改变和再确认，从而改变(gibin)基因表达产物的生物学功能。基因表达产物的生物学功能。第38页/共41页第三十九页，共41页。蛋白质工程药物的分子蛋白质工程药物的分子(fnz)设计方法设计方

32、法n n定点突变某些关键氨基酸残基n n增加、删除或调整分子上的某些肽段或结构域n n功能(gngnng)互补的两种基因的融合n n对表达产物的后修饰和改善第39页/共41页第四十页，共41页。三种目的基因提取方法的优缺点三种目的基因提取方法的优缺点仅限于合成核苷酸对较少的仅限于合成核苷酸对较少的简单基因简单基因专一性专一性最强最强化学化学合成法合成法操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳很不稳定，要求的技术条件较高定，要求的技术条件较高专一性强专一性强反转录法反转录法工作量大，盲目，分离出来工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因的有时并非一个基因操作简便操作简便广泛使用广泛使用基因文库基因文库法法缺缺 点点优优 点点第40页/共41页第四十一页，共41页。