酶反应动力学.pptx

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1、酶促反应速度受各种因素影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂、抑制剂等。酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶反应速度的各种因素的科学。The study of enzyme kinetics addresses the biological roles of enzymatic catalysts and how they accomplish their remarkable feats.意义？第1页/共51页第一节 概念一、反应速率：单位时间内反应物或生成物的浓度变化，通常用瞬时速率表示反应速率。V=-dc/dt，负号表示反应物浓度的减小；或v=+dc/dt二、反应分子数：是

2、在反应中真正相互作用的分子数目。一般为单分子反应，2分子反应，3分子少见，大于3分子未发现。第2页/共51页元素衰变，分子重排，异构体互变是单分子反应，符合：v=dc/dt=kc,其中c为mol/l,k是比例常数，谓之反应速率常数。单位：s-1双分子反应很多，符合v=dc/dt=kc1c2,c1,c2分别代表两种反应物的浓度。即与A、B成正比第3页/共51页三、反应级数：根据整个化学反应的速率服从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。如果反应速率能用单分子反应的速率方程式表示，该反应即为一级反应；反应速率与反应物浓度无关的反应谓之零级反应。凡是反应速率能用双分子速率方程描述，则为二级

3、反应。第4页/共51页但还需要区别对待，如蔗糖水解：蔗糖+H2O 葡萄糖+果糖，由于稀溶液水比蔗糖多的多，故可以视为一级反应。故反应速率只决定于蔗糖浓度：v=kcsucrose。四、各级反应的特征:一级反应：反应速率只与反应物浓度一次方成正比的反应。t 1/2为一般反应物转变为产物所需要的时间，谓之半衰期一级反应半衰期与初始浓度无关，与速率常数成反比。第5页/共51页第6页/共51页二级反应：反应物浓度二次方或两个反应物浓度乘积成正比的反应。最常见的反应。二级反应半衰期与初始浓度成反比，即初始浓度越大则半衰期越短，这是二级反应的重要特征。零级反应速率与初始浓度无关，半衰期与初始浓度成正比，即初

4、始浓度越高，则半衰期越长。第7页/共51页第二节 底物浓度对反应速率的影响一、中间复合物学说Henri 1903年蔗糖酶水解实验：酶浓度不变，改变底物浓度，开始为一级反应，中间为混合级反应，最后，底物浓度无论如何增加，反应速率不 再增加，为零级反应。表明酶可以被饱和，形成中间产物：S+E ES P+E。正比关系非正比不再增加速率第8页/共51页底物对酶促反应的饱和现象底物对酶促反应的饱和现象第9页/共51页证据：EM和X-ray diffraction observation，如DNA polymerase I；荧光光谱的变化p356；物理性质如溶解度在形成复合物后产生变化；分离得到胰凝乳蛋白

5、酶和底物复合物的结晶；透析和超速离心证据第10页/共51页二、酶促反应动力学方程式1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程米氏方程。1925,Briggs and Haldane修正：根据中间产物学说，酶促反应分两根据中间产物学说，酶促反应分两步进行步进行:第11页/共51页第12页/共51页第13页/共51页总的酶量第14页/共51页当反应速度等于最大速度一半时,即V=1/2 Vmax,Km=S上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。单位是mol/L第

6、15页/共51页第16页/共51页2.动力学参数的意义米氏常数的意义：1）它是酶的一个重要的特征物理常数，其大小与酶的性质有关而与酶浓度无关。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pHpH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。2)Km可以判断酶的专一性和天然底物。一个酶有几个底物，就由几个Km，其中Km最小的底物为其最适底物，即天然底物。第17页/共51页3）根据Km=(k2+k3)/k1,若k3k2时，Km=Ks，则ES分解即为反应的限速步骤，此时，Km值表示酶与底物之间的亲和程度：成反比关系，Km值大表示亲和程度小

7、，酶的催化活性低;Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。4）如果已知Km，可以计算某一底物浓度下，反应速率相当于Vmax的百分率，生产上，底物浓度太小，不经济，太大浪费底物。当v=Vmax时，反应速率与E0成正比，如果某一酶Km已知，则任何底物下，酶被底物饱和百分数为：fES=v/Vmax=S/(Km+S)第18页/共51页5)根据Km大小，可以判断某一代谢途径的方向和途径。GDH之NAD+Km=2.5x10-5；NADH为1.8x10-5对于一系列反应来说，Km大小可以判断反应的限速步骤。6)可用于判断反应级数：当S100Km时，=Vmax，反应为零级反应；当0.01KmS100Km时，为

8、混合级反应。Vmax的意义：同一种酶，但底物不同，则Vmax也不同，并且受pH，温度，离子强度的影响。第19页/共51页当S很大时，Vmax=k3E，此时，酶被底物饱和，k3表示酶被底物饱和时，每个酶分子转换底物的分子数，又谓之转换数（TN），又常常被称为催化常数kcat.kcat数值越大，则酶的催化效率越高。生理条件下，大多数酶不会被底物所饱和，S/Km一般介于0.01-0.1之间，根据Vmax=k3ET=kcatET,当SKm,则有：显然kcat/Km是E 和S反应形成产物的二级速率常数。第20页/共51页3.Km和Vmax的求法，米氏方程的作图：基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+

9、b的直线方程，再用作图法求出Km。By rearrangements of the M-M eq,the hyperbolic Curve can be transformed into a straight-line equation.These transformation include(1)the Lineweaver-Burk double-reciprocal plot,the best know transformation1v=KmVmax1SVmax1+第21页/共51页第22页/共51页(2)Another rearrangement of the M-M equation

10、 is the Hanes-Woolf plot by multiplying the equation by S givesGraphing s/v vs S yields a straight line wherethe slope is 1/Vmax,the y-intercept is Km/Vmax,and the x-intercept is Km.第23页/共51页第24页/共51页酶的Km在实际应用中的意义鉴定酶：通过测定Km，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。判断酶的最适底物（天然底物）。计算一定速度下底物浓度。了解酶

11、的底物在体内具有的浓度水平。判断反应方向或趋势。判断抑制类型三、多底物反应酶促动力学酶促反应有单底物，双底物和三底物三种类型p364如果是：A+B P+Q，是最重要的类型按照反应机制，多底物反应分为：1.序列反应(sequential reaction)，即底物的结合和产物的释放有一定的顺序：第25页/共51页有序反应 ordered reactions,Ordered Bi Bi随机反应：random reactions,Random,Bi Bi乙醇脱氢酶肌酸激酶第26页/共51页2.乒乓反应 Ping Pang reactions特点是在酶同A的反应产物P是在酶同第二个底物B反应前释放出来

12、，酶变为修饰酶E，再同底物B反应生成产物Q，酶恢复原状。天冬氨酸转氨酶第27页/共51页第三节 酶的抑制作用1.酶的失活作用：指使酶蛋白变性二导致的酶活性丧失作用。定义：在一定的物理化学或生物因素作用下，使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。抑制剂并非变性剂，抑制剂具有不同程度的选择性。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过 渡状态相似。b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定 的复合体或结合物。第28页/共51页一、抑制作用的类型 非专一性不可逆抑制剂 专一性不可逆抑制剂定义：酶必需基团与抑制剂共价

13、结合不能以透析、超滤等物理方法使酶活性恢复E不可逆抑制剂第29页/共51页 竞争性抑制剂可逆抑制剂 非竞争性抑制剂 反竞争性抑制剂可逆抑制剂和不可逆抑制剂的区别：非共价；动力学：以v对E作图，不可逆抑制剂曲线整体向右移动，可逆抑制剂速率降低。其特点是抑制剂与酶活性基团非共价结合，可以使用透析或超滤的方法使酶活性恢复，是可逆的Dose effect第30页/共51页四、可逆抑制作用动力学1.竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，称为竞争性抑制作用。Km变大，Vmax不变第31页/共51页第32页/共51页特点：竞争性抑制剂往往是酶的底物

14、类似物或反应产物；抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；动力学参数：Km值增大，Vmax值不变。例子：磺胺类药物等对氨基苯甲酸对氨基苯磺酰胺第33页/共51页第34页/共51页2.非竞争性抑制剂 noncompetitive inhibition,抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。VmSv=(Km+S)(1+I Ki）Km不变，Vmax降低Non-subtract binding site第35页/共51页第36页/共51页mixed inhibition,the bi

15、nding of I influence the binding of S,which produce:第37页/共51页特点：非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；动力学参数：Km值不变，Vmax值降低。例子：Leu是Arg合成酶的非竞争性抑制剂，某些重金属离子对酶的抑制作用如：Ag+,Cu2+,Pb2+,Hg2+3.反竞争性抑制uncompetitive inhibition抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑

16、制。第38页/共51页Km变小，Vmax变小第39页/共51页特点：反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；抑制程度随底物浓度的增加而增加；动力学参数：Km减小，Vmax降低。例子：肼类化合物抑制胃蛋白酶，氰化物抑制芳香硫酸酯酶。KI and KIAlso find it in p373第40页/共51页五、重要的抑制剂1.不可逆抑制作用：（1)非专一性不可逆抑制剂：有机磷-与酶活性中心Ser羟基结合。胆碱酯酶；有机汞、砷-作用与Cys之巯基，如路易斯毒气；重金属：蛋白变性失活；烷化试剂，多种基团；氰

17、化物、硫化物和CO与酶的金属离子作用；青霉素：与糖肽转肽酶活性中心ser残基结合第41页/共51页第42页/共51页(2)专一性不可逆抑制剂：Ks型不可逆抑制剂，具有底物类似结构，与酶专一性结合，其含有的活泼化学基团，可以对酶活性中心进行化学修饰，产生抑制效应。由于抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称之为亲和标记试剂affinity labeling reagent.第43页/共51页Kcat型不可逆抑制剂:抑制剂不但具有天然底物的类似结构，本身也是酶的底物，酶与之结合后，导致抑制剂潜伏反应基团暴露或活化，并与酶活性中心必需基团作用，产生抑制效应。专一性极高，谓之自杀性底物。第44

18、页/共51页2.可逆抑制剂5FU抑制胸腺嘧啶合成酶；磺胺类药物二氢叶酸合成酶过渡态类似物：烯醇式丙酮酸是LDH，ODH，PC催化过程的过渡态，草酸是烯醇式丙酮酸的类似物，可强烈抑制上述酶的活性。第45页/共51页第四节 温度对酶促反应速率的影响一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快。但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的热变性作用，反应速度迅速下降，直到完全失活。酶促反应速度随温度升高而达到一最大值时的温度就称为酶的最适温度(optimum tempe-rature)。第46页/共51页在20-50度范围内，随温度升高而增加温度提高10度，反应速率与原来速率之比谓之Q10，多数酶的Q10为2

19、.酶的最适温度与实验条件有关，因而它不是酶的特征性常数。低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低，但温度升高后，酶活性又可恢复。第47页/共51页第五节 pH对酶促反应速率的影响观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一“钟形”曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH(optimum pH)。p380第48页/共51页人体内大多数酶的最适pH在6.58.0之间，不是酶的特征常数。改变的原因：过酸、过碱破坏酶蛋白构象，导致活性丧失；pH变化不剧烈时，导致底物解离状态，活性基团解离状态等改变；影响了维持酶分子构象相关基团的解离从而也导致活性降低。第49页/共51页第六节 酶的激活剂能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。酶的激活剂大多数是无机离子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。第50页/共51页感谢您的观看！第51页/共51页