酶蛋白的化学修饰.pptx

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1、q酶的化学修饰（Chemical Chemical modificationmodification）是指用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，从而达到改变酶的催化性质及一些生理生化性质的目的。q从酶动力学角度，酶的化学修饰过程为不可逆抑制（激活）过程。q酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研究，医药、农业、酶工程、生化工程等领域。化学修饰具有易实现，作用快，成本低等优点，是一项常用的重要技术。第1页/共48页例如：1 1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的NHNHCHCH2 2COOHCOOH后，该酶对6060C C热处理的稳定性增高了1000100

2、0倍。2 2、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)superoxide dismutase,SOD)、尿酸酶等用PEGPEG修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15154545。第2页/共48页回顾酶分子的几个部分 肽链：酶分子的骨架，形成基本的空间结构，酶分子的基础。N端及C端：氨基和羧基有参加催化功能的可能。侧链基团：是形成活性中心特定构象和性质的组成部分，是完成催化反应的实际参加者。第3页/共48页 对侧链基团进行化学修饰是改造酶的性质和功能的重要手段。第4页/共48页第一节化学修饰的方法学 着手蛋

3、白质修饰工作时,首先碰到的是修饰试剂和修饰条件的选择,以期提高修饰反应的专一性,获得满意的修饰结果。第5页/共48页1 1、试剂的选择 实验目的不同,对专一性的要求也不同,因此,选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。例如,对氨基的修饰有几种情况:修饰所有氨基,而不修饰其他基团;仅修饰-氨基;修饰暴露的或反应性高的氨基 修饰具有催化活性的氨基等。第6页/共48页选择蛋白质修饰剂要考虑的问题:修饰反应要完成到什么程度;对个别氨基酸残基是否专一;在反应条件下,修饰反应有没有限度;修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变;是否需要分离修饰后的衍生物;反应是否需要可逆；能否建立快速、方便的分析方法等。第7页/共

4、48页 特别注意：修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下特征:选择性地与一个氨基酸残基反应;反应在酶蛋白不变性的条件下进行;标记的残基在肽中稳定,很易通过降解分离出来,进行鉴定:反应的程度能用简单的技术测定。第8页/共48页2 2、反应条件的选择 除允许修饰能顺利进行外,还必须满足如下要求：不造成蛋白质的不可逆变性。有利于专一性修饰蛋白质。为此,反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。反应的温度、pH都要小心控制。反应介质和缓冲液组成也要有所考虑。第9页/共48页3.反应的专一性专一性非常重要。除控制反应条件外,还可利用其他途径来实现修饰的专一性。利用蛋白质分子中某

5、些基团的特殊性。例：二异丙基氟磷酸酯(DFP)能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用,迅速导致酶失活。但DFP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。这种现象称为位置专一性,因为这是由于它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。第10页/共48页选择不同的反应pH 蛋白质分子中各功能基的解离常数(pKa)是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度,从而有利于修饰的专一性。第11页/共48页例如：碘代乙酸对蛋白质进行修饰时,试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及-氨基、-氨基发生作用。第12页/共48页利用某些产物的不稳定性亲和标记差别标记利用蛋白质状态的差

6、异第13页/共48页第二节 酶蛋白侧链的化学修饰 1、蛋白质侧链上的功能基主要有:氨基（N端，赖氨酸，精氨酸），巯基（半胱氨酸），羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑基（组氨酸），吲哚基 胍基第14页/共48页2、各基团的化学修饰（1）修饰羧基（三类修饰剂）1)碳二亚胺类+第15页/共48页2)甲醇+CH3OHHCl+H2O第16页/共48页3）硼氟化三甲烊盐 （CH3）3 OBF4+HBF4+CH3OCH3第17页/共48页（2）修饰氨基（四类）赖氨酸氨基有很高的亲核反应性，可用多种酰基化试剂或烷基化试剂对其修饰 1）烷基化第18页/共48页2）酰基化乙酸酐：丹磺酰氯（DNS）

7、：第19页/共48页3）还原烷基化4）一个常用的特异修饰赖氨酸氨基的试剂：磷酸吡哆醛第20页/共48页（3）修饰胍基 （两类）1）二酮：丁二酮：环己二酮：第21页/共48页2）苯乙二醛：第22页/共48页（4）修饰巯基（四类）巯基是活性部位最常出现的基团，也是有最多修饰剂的基团。巯基修饰剂可分为以下四类：二硫键交换，烷基化，酰基化，重金属化合物。1）二硫键交换：ESH+RSSRESSR+RSHESH+ESSRESSE+RSH 与SH进行二硫键交换后，SH被修饰，试剂的另一半以单体放出。第23页/共48页常用的二硫键交换试剂：DTNB，5,5-dithio-bis-(2-Nitrobenzoat

8、e)第24页/共48页二硫二吡啶，4,4-dithiodipyridine（或2,2-dithiodipyridine）二硫键交换产生的单体在一定波长下有很大光吸收，可用分光光度法定量连续监测。第25页/共48页2 2）重金属化合物：对氯汞苯甲酸（PCMBPCMB）ESH+HCl第26页/共48页2-2-氯汞-4-4-硝基酚 ESH +HCl第27页/共48页3 3）烷基化：E-SH+R-X E-SR+HX E-SH+R-X E-SR+HX常用烷基化试剂：碘代乙酰胺（IAM）碘代乙酸（IAA）第28页/共48页一个常用的专一修饰巯基试剂：N-N-乙基马来酰亚胺（NEMNEM）:ESH第29页/

9、共48页4 4）酰基化：OESH E-S-C-R+HX第30页/共48页（5）修饰咪唑基（两种）通常通过对咪唑基上氮原子酰基化或烷基化修饰组氨酸咪唑基。1)焦碳酸二乙脂（diethyl paracarbonate）是最常用的一个试剂：+C2H5OH+CO2第31页/共48页2)碘代乙酸：+ICH2COOH+HI第32页/共48页（6 6）吲哚基的化学修饰）吲哚基的化学修饰 来源：来源：TrpTrp 修饰反应：修饰反应：氧化反应氧化反应 修饰剂：修饰剂：N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺第33页/共48页（7）修饰酪氨酸残基（三种）1）碘化反应：I2+HI第34页/共48页2）硝化：（NO2)

10、4C+(NO2)3CH第35页/共48页3）N-乙酰咪唑:N-ethyl imidazole 第36页/共48页氨基酸氨基酸侧链基团侧链基团修饰剂修饰剂LysLys氨基氨基三硝基苯磺酸，三硝基苯磺酸，2 2，4 4二硝基氟苯、碘乙二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸AspAsp、GluGlu羧基羧基水溶性碳化二亚胺水溶性碳化二亚胺ArgArg胍基胍基苯乙二醛，苯乙二醛，1,21,2环己二酮、丁二酮环己二酮、丁二酮CysCys巯基巯基碘乙酸、碘乙酰胺、碘乙酸、碘乙酰胺、N-N-乙基马来酰亚胺乙基马来酰亚胺二硫键二硫键巯基乙醇、巯基乙醇、DTTDTTHisH

11、is咪唑基咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸焦碳酸二乙酯、碘乙酸TyrTyr酚羟基酚羟基碘、四硝基甲烷碘、四硝基甲烷TrpTrp吲哚基吲哚基N-N-溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂第37页/共48页3.有机大分子对酶的化学修饰 有机大分子对酶的化学修饰是利用一些活性分子把特定的有机大分子结合到酶上，以改变酶的生理、生化性质，实现特定目的的技术。该技术可用于改变酶的稳定性、组织分布性、抗原性及其它生化性质，在医药、工业等领域有着广泛的应用前景。第38页/共48页1）聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）聚乙二醇是一个线性分子，有良好的生物相容

12、性，在体内不残留，无毒，无抗原性，是一种优良修饰剂。其修饰方法有多种，如三氯均嗪法、叠氮法、琥珀酸酐法、重氮法等。三氯均嗪法是一个常用的方法。三氯均嗪上氯原子很活泼，易发生亲核取代。三个氯原子反应性依次下降。第39页/共48页2）右旋糖酐 右旋糖酐是由-葡萄糖经-1，6糖酐键形成的多糖，有较好的水溶性及生物相容性，可用作代血浆。右旋糖酐链上的双羟基结构经活化后可与酶上的自由氨基相结合。溴化氰法是右旋糖酐修饰酶分子的常用方法。邻双羟基在溴化氰作用下活化，然后在碱性条件下可与酶分子上氨基反应，共价结合。第40页/共48页3）肝素 肝素有抗凝血、抗血栓、降血脂活性，适于修饰溶栓酶类以增加疗效。碳二亚

13、胺法第41页/共48页5 5）白蛋白碳二亚胺法第42页/共48页第三节 酶的亲和修饰亲和标记(Affinity Labeling）亲和标记是最有意义的一种化学修饰，这是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位特定基团，一般是必需基团，而造成不可逆失活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团。第43页/共48页 作用于组氨酸侧链的试剂TPCK和TLCK是一个典型例子TPCKTLCK第44页/共48页 亲和标记试剂在酶上具有特定结合部位，其解离常数也易于测定，可以提供酶的结构信息，是理论研究中的一类常

14、用的修饰剂。亲和标记试剂一般可以在较低浓度下有效修饰酶，改变酶的活性，特别是专一性较强，是药物等的优良候选者，有广泛的应用价值。第45页/共48页第四节酶化学修饰的应用酶经过化学修饰后会产生的变化：1.提高生物活性；2.增强在不良环境中的稳定性；3.针对特异性反应降低生物识别能力，解除免疫原性；4.产生新的催化能力。第46页/共48页在医药方面：化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期，抑制免疫球蛋白的产生，降低免疫原性和抗原性。在生物技术领域：化学修饰酶能够提高酶对热，酸，碱和有机溶剂的耐性，改变酶的底物专一性和最适ph等酶学性质。在酶结构功能研究中：1.研究酶空间结构与功能的关系，如酶的活性中心研究；2.确定氨基酸残基的功能；3.测定酶分子中某种氨基酸的数量。第47页/共48页感谢您的观看！第48页/共48页