种子扩大培养课件.ppt

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1、种子扩大培养种子扩大培养 种子扩大培养是指将保存在砂砂土土管管、冷冷冻冻干干燥燥管管中中处处休休眠眠状状态态的的生生产产菌菌种种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子种子。n n 种子扩大培养应根据菌种的生理特性菌种的生理特性，选择合适的培养条件合适的培养条件来获得代谢旺盛、数代谢旺盛、数量足够的种子量足够的种子。n n 培养良好的种子接入发酵罐后，将使发发酵生产周期缩短，设备利用率提高酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作关键性的作用用。优良种子应具备的条件优良种子应具备的条件n n活力

2、强n n生理状态稳定n n菌体数量浓度达到要求n n无杂菌污染n n适应性强，能保证稳定生产种子质量的判定种子质量的判定n n通常测定的参数包括n npHn n培养基中营养物质的含量n n菌丝形态、色泽、浓度n n酶活，溶解氧，尾气等实验室制备阶段实验室制备阶段n n实验室阶段：实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。实验室阶段实验室阶段培养物选择的原则培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽胞的微生物对于不产孢子和芽胞的微生物

3、 获得一定数量和质量的菌体对于产孢子的微生物对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子，获得一定数量和质量的菌丝体n n斜面培养基接种法斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。操作方法：操作方法：1 1、以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。2 2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置置3737温箱孵育温箱孵育18-2418-24小时

4、，取出观察斜面上菌苔生长情况。小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。生产车间种子的制备生产车间种子的制备n n孢子或摇瓶菌丝在实验室中制备好后，即可转移到种子罐中扩大培养。n n种子罐的作用是使有限的数量的孢子或菌丝生长繁殖成大量的菌丝体。n n种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌生产车间阶段生产车间阶段培养物的选择原则：培养物的选择原则：在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：菌丝体比孢子要有利：种子扩大的级数种子扩大的级

5、数n n指制备种子需逐级扩大培养的次数，需要根据菌种的生长繁殖速率，发酵罐的容积综合确定。n n一级种子二级发酵：谷氨酸棒杆菌n n二级种子三级发酵：青霉菌n n三级种子四级发酵：灰色链霉菌 种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。种龄与接种量种龄与接种量n n种龄种龄：种子的培养时间。n n接种量接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。双种双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。影响种子质

6、量的因素n n原材料质量一般情况：培养基糖分相对要少，氮源要多，无一般情况：培养基糖分相对要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。成分的数量根据目的各自确定。n n培养条件 如温度、如温度、PHPH值、湿度、培养时间和冷藏时间等值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质量。都影响种子质量。种子质量的控制种子质量的控制n n菌种的稳定性检查与复壮n n无杂菌检查青霉素生产的种子制备青霉素生产的种子制备制备过程制备过程安培管安培管 斜

7、面孢子斜面孢子 大米孢子大米孢子 一级种子一级种子 二级种子二级种子 发酵发酵斜面孢子斜面孢子培养基：甘油、培养基：甘油、葡萄糖、葡萄糖、蛋白胨等蛋白胨等培养基特点培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细有利于长孢子，用量少而精细培养条件：培养条件：25、7天天,注意湿度注意湿度50%左右左右大米孢子大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：培养条件：2

8、5、7天，控制湿度天，控制湿度大米孢子的要求大米孢子的要求：1粒米含粒米含1.4*106个孢子个孢子一级种子一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的目的：长菌体长菌体培养条件：培养条件：27，40小时小时接种量：接种量：200亿孢子亿孢子/吨吨二级种子二级种子培养基：同上培养基：同上培养条件：培养条件：27、10-14小时小时接种量：接种量：10%种子的质量要求种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强发酵动力学发酵动力学n n分批发酵动力学微生物生

9、长分为：迟滞期、对数生长期、稳定期和死亡期在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因为当菌种接种入一个新的环境，细胞内的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。随着细胞生长，培养液中的营养物减少，废物积累，导致细胞生长速率下降，进入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大于生成速率，进入死亡期当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很快，比生长速率几近常数。这个时期称为对数生长期代谢产物合成与微生物生长的关系代谢产物合成与微生物生长的关系n n微生物发酵中，所消耗的底物主要用于3个方面：n n合成新的细胞物质n n合成代谢产物n n提供能量按产物的生成与微生物生长关系的动力学模

10、式分为三种类型按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型(a)：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度(b)：部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式。：部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式。(c)：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的浓度有关。浓度有关。生长相关型生长相关型n n指产物的生产与细胞的生长密切相关，产物

11、的生成是微生物主要能量代谢的直接结果。n n产物通常为细胞生长必须的初级分解代谢产物，如葡糖酸等生长部分相关型生长部分相关型n n产物是能量代谢的间接结果，不是底物的直接氧化产物，产物的生成与细胞生长部分偶联。n n主要有柠檬酸、氨基酸发酵非生长相关型非生长相关型n n产物的生成与能量代谢没关系，与细胞生长也无直接关系，产物均为次级代谢产物，细胞进入稳定期后产物才开始大量合成。n n在基质消耗和菌体生长后，菌体利用中间代谢反应来形成产物。分批培养的优缺点分批培养的优缺点优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点 存在底物抑制或限制问题，对于底物类型及初始浓度敏感的次级代

12、谢物就不适用，设备利用效率较低，产率不高。补料分批培养补料分批培养 在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中采用这种方法很多。补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会半连续培养半连续培养在补料

13、分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液（带放）称为半连续培养。优点优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提高了总产量。缺点缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大连续培养连续培养发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。n n常用的连续培养方法有：n n恒浊法恒浊法n n恒化法恒化法 n n恒浊法恒浊法 是以培养器中微生物细胞的密度微生物细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本

14、恒定的流速流出，从而使培养器中的微生物在保持细胞密度基本恒定细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。n n用于恒浊培养的培养装置称为恒浊器恒浊器 n n用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的 n n恒化法恒化法是通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调控微生物生长繁殖与代谢速度的连续培养方式。用于恒化培养的装置称为恒化器。恒化连续培养在研究微生物利用某种底物进行代谢的规律方面被广泛采用。因此，它是微生物营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调控等基础与应用基础研究的重要技术手段。n n连续发酵的优点：n n在

15、发酵达到稳定后，其非生产时间大大减少，设备利用效率高，生产能力大，产品质量较稳定，工艺易于实现自动化n n缺点：染菌和菌种退化n n如果不发生污染杂菌，不出现菌种退化，连续培养是不是能一直生产下去？发酵过程工艺控制的目的发酵过程工艺控制的目的有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来目标是得到最大的比生产速率和最大的生产率发挥菌种的最大生产潜力要考虑菌种本身的代谢特点菌种本身的代谢特点：生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率菌代谢与环境的相关性菌代谢与环境的相关性：温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前体，也可能合成副产物，而这些前体有可能流向不同的反应方向，环境条件的差异会引发代谢朝不同的方向进行。微生物的生长与产物合成有密切相关性，不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少，而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水平全面的认识发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有不确定性和复杂性。