分子生物学吕社民转基因生物与基因打靶.ppt

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1、第第12章章 转基因生物和基转基因生物和基因打靶因打靶 Transgenic animal and gene targeting第一节第一节 转基因动物转基因动物 transgenic animall概念概念:指用人工方法将外源基因导入或整指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。物。l特点：分子及细胞水平的操作，组织和特点：分子及细胞水平的操作，组织和整体水平的表达。整体水平的表达。l目的：培育新种，获取人类所需的生物目的：培育新种，获取人类所需的生物产品，或进行基因功能的研究。产品，或进行基因功能的研究。转基因研究大事记转基因研究

2、大事记 1974年，美国学者年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法应用显微镜注射法把基因导入真核细胞。把基因导入真核细胞。1981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠。年获得转基因小鼠。1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌羊的乳汁中可以分泌抗胰蛋白酶。抗胰蛋白酶。1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得

3、了纯系转基因小鼠。获得了纯系转基因小鼠。1997年年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊研组公布体细胞克隆羊“多利多利”培育成功。培育成功。1997年年10月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出3只携带有人凝血因子只携带有人凝血因子基因转染绵羊。基因转染绵羊。1999年年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国中国十大科技进展十大科技进展”之一。

4、之一。2000年年6月月22日晚日晚8时整，生物胚胎工程专家张时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授（右），谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授（右），曾溢滔院士（中）曾溢滔院士（中），转基因试管牛，转基因试管牛“滔滔滔滔”思考题思考题l转基因动物的制备应包括那些环节？转基因动物的制备应包括那些环节？l制备转基因动物可能会遇到哪些问题？制备转基因动物可能会遇到哪些问题？l你认为可采用哪些方法去解决？你认为可采用哪些方法去解决？三、转基

5、因动物建立流程三、转基因动物建立流程 1、待转移的目的基因的获得与设计、待转移的目的基因的获得与设计 2、动物遗传背景及种系的选择、动物遗传背景及种系的选择 在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及 种系的问题。种系的问题。3、常用的细胞、常用的细胞 1）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵基因操作基因操作注射注射假孕动物子宫假孕动物子宫胚胎胚胎个体。个体。2）胚胎干细胞胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞中分离多功能胚胎干细胞 基因操作基因操作注射入动物囊胚注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎嵌嵌合个体。合个体。5、导入

6、基因、导入基因l显微注射法显微注射法：l用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，中，从而得到转基因动物。从而得到转基因动物。l特点：导入速度快，操作简单，对特点：导入速度快，操作简单，对DNA大小大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。以直接获得纯系。l缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的

7、插入突无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死变，引起相应的性状改变，重则致死 l逆转录病毒感染法：逆转录病毒感染法：l将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。中去。l特点：用于分裂后的早期胚胎，特

8、别适于禽类的特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽类的转基因研究。单点单拷贝插入，外源基因的完整转基因研究。单点单拷贝插入，外源基因的完整性不易被破坏。性不易被破坏。l精子载体法：精子载体法：l经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵子结合，受精。子结合，受精。l6、接受外源基因的个体的产生、接受外源基因的个体的产生 l1）受精卵：受精卵）受精卵：受精卵基因操作基因操作注射假注射假孕动物子宫孕动物子宫胚胎胚胎个体。个体。2）胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞分离多功能胚胎干细胞 基因操作基因操作注注射

9、入动物囊胚射入动物囊胚形成嵌合体胚胎形成嵌合体胚胎嵌合嵌合个体个体5转基因动物模型的建立转基因动物模型的建立建立鼠系建立鼠系转基因动物中外源转基因动物中外源DNA的检测的检测l染色体和基因水平：分离基因组染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行斑点杂交，进行斑点杂交，Southern杂交和杂交和PCR分分析，原位杂交等以评估外源基因的整合析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。情况。l转录水平：转录水平：Northern杂交，杂交，RT-PCR。l蛋白质水平：蛋白质水平：Western印渍分析。印渍分析。动物转基因技术面临着一些问题动物转基因技术面临着一些问题l生产效率低生产效率低l基因整合效

10、率不高基因整合效率不高l生产周期长，成本高生产周期长，成本高l转基因动物死亡率高转基因动物死亡率高l常出现不育导致转基因难以传代常出现不育导致转基因难以传代l无法大规模生产无法大规模生产转基因克隆动物转基因克隆动物一一、转基因克隆技术是转基因技术和动物转基因克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合。它以转基因细胞克隆技术的有机结合。它以转基因细胞为核供体，采用体细胞核移植技术产生为核供体，采用体细胞核移植技术产生转基因克隆动物，实现种质创新。转基因克隆动物，实现种质创新。二、转基因克隆动物技术显示出现的优势：二、转基因克隆动物技术显示出现的优势：1 1、生产效率高、生产效率高 2 2、周期

11、短，成本低、周期短，成本低 3 3、可以决定后代性别、可以决定后代性别 转基因动物的应用转基因动物的应用l研究不同发育阶段基因组织和功能，研究不同发育阶段基因组织和功能，细胞细胞发育的潜能性，细胞核与细胞质的相互关系，发育的潜能性，细胞核与细胞质的相互关系，胚胎发育调控，肿瘤，神经与发育等。胚胎发育调控，肿瘤，神经与发育等。l动物新品种的培育动物新品种的培育l构建医用或食用蛋白的反应器构建医用或食用蛋白的反应器l用于疾病相关的研究及建立疾病的动物模用于疾病相关的研究及建立疾病的动物模型型l可作为器官移植的供体可作为器官移植的供体第二节第二节 转基因植物转基因植物l概念概念:指用人工方法将外源基

12、因导入或整合指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类植物。到基因组内，并能稳定传代的一类植物。l方法：获取目的基因方法：获取目的基因受体细胞培养受体细胞培养将目将目的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转化农杆菌，后者再转化受体细胞）化农杆菌，后者再转化受体细胞）培养转培养转化细胞化细胞筛选阳性细胞筛选阳性细胞培植阳性植株培植阳性植株转转基因植株的鉴定基因植株的鉴定l另外，也有用病毒介导的基因转移，电击法，另外，也有用病毒介导的基因转移，电击法，基因枪法，显微注射，脂质体介导法，多聚基因枪法，显微注射，脂质体介导法，多聚物介导法，激光束

13、穿孔法等物介导法，激光束穿孔法等l转基因植物实际上，可以被看作生物制转基因植物实际上，可以被看作生物制备器，主要用于：备器，主要用于：生产药物蛋白生产药物蛋白 制备口服疫苗制备口服疫苗l获得品质更好的中药材获得品质更好的中药材l获得新的农作物品种：获得新的农作物品种：抗虫棉花，抗旱小麦等抗虫棉花，抗旱小麦等转基因植物的应用转基因植物的应用基因打靶基因打靶 gene targeting一、概述：基因打靶是利用一、概述：基因打靶是利用DNA同源重组同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段

14、。包括基因敲除（有效手段。包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（）和基因敲入（gene knock in）。）。l同源重组的分子过程同源重组的分子过程1、两、两段段较长的同源较长的同源DNA或同源染色体彼此靠或同源染色体彼此靠拢，在二条相同极性上断裂拢，在二条相同极性上断裂2、产生交叉结构、产生交叉结构3、在交叉处横断内切，产生、在交叉处横断内切，产生4种含有异源双链种含有异源双链的重组产物的重组产物二、基因敲除的基本程序二、基因敲除的基本程序1、构建打靶载体、构建打靶载体 1）同源序列）同源序列 2）打靶载体常含两种筛选标志打靶载体常含两种筛选标志 neor：新霉素抗性基因

15、，阳性筛选标志，：新霉素抗性基因，阳性筛选标志，neor基因插入用于打靶的外源基因插入用于打靶的外源DNA中，中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。中生长。neorHSV-tk HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志，基因，阴性筛选标志，该基因产物可分该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。生自杀效果。HSV-tk基因插入外源基因外侧的载基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，体序列中。同源重组时，Tk-基因往往丢基因往往丢失；随机整合时，失；随机

16、整合时，Tk-基因连同打靶载体基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时获得整合到核基因组上，而同时获得neo和和HSV-tk两个基因的打靶细胞。两个基因的打靶细胞。启动子启动子HSV-TK同源序列同源序列同源序列同源序列Neo2、将载体导入将载体导入ES细胞细胞 选取发育第选取发育第4-5天的胚胎干细胞天的胚胎干细胞(ES)。把外来基因转入胚胎肝细胞。把外来基因转入胚胎肝细胞。并筛选打靶成功的细胞。并筛选打靶成功的细胞。随机整合随机整合同源重组同源重组3、将基因敲除、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。合胚胎。4、将、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。个胚泡植入

17、假孕小鼠子宫。5、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。常有的方法有：常有的方法有：Southern印记、印记、Northern印记印记把胚胎注入把胚胎注入假孕小鼠假孕小鼠Southern印记印记把细胞注入胚泡把细胞注入胚泡6、杂和小鼠（、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代小）间杂交，获得子二代小鼠（鼠（+/+、-/-、+/-）。）。7、筛选的、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）三三、基因打靶在医学中的应用、基因打靶在医学中的应用1、采用

18、基因打靶技术可建立基因缺陷型的、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分子机制。子机制。2、基因打靶与肿瘤的研究、基因打靶与肿瘤的研究 研究基因改变研究基因改变与肿瘤发生及治疗的关系与肿瘤发生及治疗的关系3、基因打靶可用于构建高效的动物反应器、基因打靶可用于构建高效的动物反应器或植物反应器，用于药物生产。或植物反应器，用于药物生产。小结小结 转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新

19、的物种提供了新的思路，的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的手段。了有力的手段。基因打靶是一种利用同源重组原理使基因定向重基因打靶是一种利用同源重组原理使基因定向重组的方法。它是我们可以更精确的研究一个基因的组的方法。它是我们可以更精确的研究一个基因的功能。也部分解决了构建转基因动物是基因随机重功能。也部分解决了构建转基因动物是基因随机重组给我们带来的一些困扰。组给我们带来的一些困扰。不论转基因动物还是基因打靶对于研究有什么意不论转基因动物还是基因打靶对于研究有什么意义，要想把它们在生活中推广还要通过艰苦的研究义，要想把它们在生活中推广还要通过艰苦的研究来对其进行更深入的认识。更要随时牢记：我们并来对其进行更深入的认识。更要随时牢记：我们并不真的是上帝。不真的是上帝。谢谢观赏谢谢观赏