结核病诊断T-SPOT实验.ppt

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1、汇汇汇汇 报报报报 人：人：人：人：培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科培训专业：呼吸内科指导老师：指导老师：指导老师：指导老师：01010202结核病实验室检查及意义目录01.分枝杆菌概述02.结核病实验室检查03.小结2分枝杆菌概述013分枝杆菌属分类结核分枝杆菌(M.tuberculosis)非结核分枝杆菌（NTM）麻风分枝杆菌（M.leprae）4结核分枝杆菌的发现1882年 德国国柯赫医医生发现结核致病菌-结核杆菌5结核杆菌的变迁1897年提出结核病的飞沫传播1922年，卡介苗为预防结核病首次对新生儿儿接种种1945年，链霉素的问世使肺结核不再是不治之症。6结核分枝

2、杆菌特点(M.tuberculosis)生物学学主要特点：1.细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性并并伴肉芽肿3.抗酸染色阳阳性7结核病由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病由结核分枝杆菌引起的慢性感染性疾病8结核病临床表现症 状状 体 征 1.全身症状状：消瘦、盗盗汗、低热、乏力2.呼吸系统症状状：咳嗽、约1/3咯血3结核变态反应表现因肺结核好发于肺上叶尖后段及下叶背段，故锁骨上下、肩胛间区区叩诊音浊9结核病发病机制起始起始期期细胞外增殖期和传播期细胞外增殖期和传播期共生期共生期T T细胞反应期细胞反应期10结核病发病机制结核分枝杆菌通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，结核分枝杆菌

3、通过飞沫进入呼吸道，被肺泡巨噬细胞吞噬杀灭，不留任何痕迹和感染证据。不留任何痕迹和感染证据。特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答特点：不存在结核杆菌复制，不存在免疫周围细胞的免疫应答结结核核分分枝枝杆杆菌菌在在体体内内复复制制，形形成成感感染染灶灶，由由T T细细胞胞介介导导的的细细胞胞免免疫疫和迟发型变态反应，进一步清除细菌。和迟发型变态反应，进一步清除细菌。特点：激活体内免疫反应（特点：激活体内免疫反应（CMICMI和和DTHDTH），宿主获得抗结核抵抗力），宿主获得抗结核抵抗力11结核病发病机制 在在低低氧氧、低低pHpH、抑抑制制性性脂脂肪肪酸酸和和宿宿主主免免疫疫机

4、机制制共共同同作作用用下下抑抑制制细细菌菌的的增增殖殖。结结核核分分枝枝杆杆菌菌未未被被完完全全清清除除，细细菌菌和和宿宿主主处处于于共共生生状状态态，结结核核杆杆菌菌主主要要存存在在于于坏坏死死组组织织中中央央。特特点点：可可激激发发和和维维持持T T细细胞胞的的免免疫疫记记忆忆，在在一一定定条条件件下下再次发病再次发病长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起结核病长期休眠的结核细菌在一定条件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起结核病特点：结核播散特点：结核播散12接触活动性结核病患者接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除暴露程度不足，结核杆菌被机

5、体免疫力清除-没有症状没有症状,结核杆菌仍旧结核杆菌仍旧存在而不能存在而不能被检测被检测 -X-X-光光/CT/CT 扫描显示正常扫描显示正常-没有抗体应答没有抗体应答-诊断困难诊断困难-传统的结核感染检测只有传统的结核感染检测只有 TSTTST（PPDPPD）机体被感染机体被感染受机体免疫力抑制受机体免疫力抑制没有临床症状没有临床症状终身处于感染状态终身处于感染状态潜伏感染潜伏感染有临床症状有临床症状具有传染性具有传染性-结核杆菌可以通过涂片、结核杆菌可以通过涂片、培养检测出培养检测出-胸部的胸部的 X-X-光或光或 CT CT 扫扫描显示异常描显示异常 -肺外结核难以诊断肺外结核难以诊断

6、(特别是儿童特别是儿童)活动性结核活动性结核5%5%再次激活再次激活活动性结核与潜伏感染活动性结核与潜伏感染13结核病诊断实验室检查影像检查病理检查+临床 指征14结核杆菌实验室检查02结核诊断-临床应用几几乎乎所所有有的的临临床床内内科科科科室室都需要结核的鉴别诊断：都需要结核的鉴别诊断：发热待查，结核排筛发热待查，结核排筛结脑的鉴别诊断结脑的鉴别诊断胸腹水患者待查胸腹水患者待查儿童结核儿童结核16结核杆菌结核病实验室检查细菌学学检查免疫学学检查分子生物学学检查分枝杆菌分离培养养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种种鉴定体液免疫学学诊断断细胞免疫学学诊断断DNA测序DNA探针技术聚合酶链反应（PCR

7、）17结核分枝杆菌-实验室检查涂片镜检细菌学学检查适用于多种种标本；操作简便，价格低廉。2份份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳阳性；1份份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳阳性+肺部影像学学检查符合活动性肺结核表现。肺结核治疗评估的主要依据之一 18结核分枝杆菌-实验室检查缺点：不能区区别是否为非结核分枝杆菌 不能区区别死活菌。结核杆菌暴露于异异烟肼时，某些条条件会会失去抗酸性，出现假阴阴性。检测灵灵敏度较低（104-105 个个细菌/毫升）。19结核杆菌培养细菌学学检查传统方法：传统方法：L-JL-J固体培养基固体培养基快速培养法快速培养法:检检测测细细菌菌生生长长过过程程中中代代谢谢产产生生的的CO

8、2CO2或或消消耗耗的的O2O2，显显微微镜镜直直接接观观察、变色液体培养基等察、变色液体培养基等BACTEC MGIT960BACTEC MGIT960系统系统 BACTEC460BACTEC460系统、系统、Bact/ALERT 3DBact/ALERT 3D、ESPESP等。等。痰培养、其他标本培养痰培养、其他标本培养20结核杆菌培养阴性培养阴性培养阳性培养阳性培养无或微弱荧光无或微弱荧光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2强荧光强荧光传感器传感器对氧气高度敏感的钌复合

9、物对氧气高度敏感的钌复合物肉汤肉汤改良改良Middlebrook 7H9肉汤肉汤上部空间上部空间已预先充填已预先充填10%CO2BACTECBACTEC MGIT MGIT 960/320 960/320 指示器系统指示器系统指示器系统指示器系统21结核杆菌培养1 1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1 1份痰标本结核分枝杆菌培养份痰标本结核分枝杆菌培养 痰痰涂涂片片阴阴性性，肺肺部部影影像像学学检检查查符符合合活活动动性性肺肺结结核核影影像像学学表表现现+1+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性份痰标本结核分枝杆菌培养阳性用于耐多药结核疗效判定结核菌培养养临床价值确

10、诊结核22抗酸杆菌培养优缺点敏感性较直接涂片法高，理论上10-10010-100条条菌/毫升可检出阳阳性；特异异性较直接涂片法高，可以从从菌落生长速度、色素产生初步判断断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养养物，为进一步药敏试验提供基础。需时长，根据接种种量的大小，一般2-82-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运运送时间、培养养基成分和质量、前处理方法等影响响，操作较直接涂片法复复杂，需经严格培训 。需培养养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温温培养养箱等设备。成本是直接涂片法的7-87-8倍。23细胞免疫学检查结核菌素皮肤核菌素皮肤试验（PPD试验）干干扰素素释放放试验（T-SP

11、OT试验）24免疫学检查细胞免疫学检查细胞免疫学检查PPD-PPD-结核菌素试验结核菌素试验迟发型细胞超敏反应迟发型细胞超敏反应1 1）方法：）方法：1:2000 OT1:2000 OT或或PPDPPD液液0.10.1毫升毫升(5(5单位单位)，左左前臂屈侧中部前臂屈侧中部皮内注射，皮内注射，48-72h48-72h测量皮肤测量皮肤硬结硬结的直的直径径。25PPD-结核菌素试验2 2）判断标准判断标准：阴性阴性4mm4mm弱阳性弱阳性5-9mm5-9mm阳性阳性10-19mm10-19mm，强阳性强阳性20mm20mm或局部出现水泡与坏死或局部出现水泡与坏死26PPD-结核菌素试验3)3)结核

12、菌素试验的意义结核菌素试验的意义阴性阴性：无结核菌感染；不能排除结核感染。：无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性阳性：曾有结核感染，并不一定现在患病。：曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性强阳性：活动性结核病可能：活动性结核病可能 A、变态反应尚未建立；、变态反应尚未建立；B、免疫抑制如应用皮质、免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等激素或营养不良等27PPD-结核菌素试验 PPDPPD所含抗原所含抗原为致病性分枝杆菌、致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有，其株所共有，其结果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影果受到卡介苗接种及其他分枝杆菌感染的影响，响，特异性特异

13、性较差差。当出当出现免疫功能低下免疫功能低下时可出可出现假阴性假阴性结果果，敏感性低敏感性低。免疫力正常的阴性有一定意免疫力正常的阴性有一定意义。强阳性有一定意阳性有一定意义。有。有结核核变态反反应、淋巴、淋巴结核核强阳性多。阳性多。经济、简便，可以用于流行病学大便，可以用于流行病学大规模的模的筛查和普和普查，但，但存在着明存在着明显的缺陷。的缺陷。PPDPPD试验临床价值28T-SPOT实验细胞免疫学检查细胞免疫学检查T-SPOTT-SPOT试验原理试验原理结核感染者体内存在特异的效应结核感染者体内存在特异的效应T T淋巴细胞，效应淋巴细胞，效应T T淋巴细胞再次受到淋巴细胞再次受到结核抗原

14、刺激时会分泌多种细胞因子（结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-IFN-）。）。因此，因此，检测效应检测效应T T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式既用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来。将其表现出来。刺激抗原：ESAT-6ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶靶6）、CFP-10CFP-10蛋白（培养养滤液蛋白）由结核分枝杆菌特有的RD1RD1基因编码，可刺激活化的效应T T淋巴细胞产生干扰素。RD1RD1基因在BCGBCG以及大部分环境分枝杆菌中

15、缺失。29T-SPOT试验干扰素检测阴阴性干扰素干扰素检测阳性检测阳性TB抗原多肽T细胞活化T细胞 干扰素30T-SPOT步骤31T-SPOT灵敏度ReferenceSensitivity Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53100.0%(12/12)Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34*83.3%(20/24)Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30*96.6%(84/87)Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50*91

16、.3%(21/23)Meier et al EJCMID 2005 24;529-53695.9%(70/73)Kang et al Chest.2007 Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-898.3%(57/58)Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44.90.0%(27/30)Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8*92.9%(26/28)Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35

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19、z et al.Diagn Microbiol Infect Dis.2008.*Epub ahead of print84.2%(32/38)Goletti et al.PLoS ONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshard et al.Respir Med.2008.Epub ahead of print98.4%(62/63)Higuchi Med Microbiol Immunol.2008.Epub ahead of print*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)灵灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响响，在肺外结核

20、患者中有很高的检出率 美国国FDA数数据：灵灵敏度95.6%(175/183)国内国内临床数数据：灵灵敏度95.3%(624/655)32结核杆菌 特异异性高只针对结核分枝杆菌复复合群敏感，与与绝大多数数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国国FDA数数据：特异异性97.1%(297/306)国内国内临床数数据：特异异性94.1%(478/508)33PPD皮试与T-SPOT试验PPD皮试皮试T-SPOTT-SPOT试验试验估计的敏感性估计的敏感性(活动性结活动性结核的患者）核的患者）7590%（对免疫抑制患对免疫抑制患者的敏感性进降低明显者的敏感性进降低明显）7595%（对免疫抑制患

21、者对免疫抑制患者的敏感性降低不明显的敏感性降低不明显）估计的特异性（无结核估计的特异性（无结核病史或暴露史的健康人）病史或暴露史的健康人）7095%（接种（接种BCG者的者的特异性进一步降低）特异性进一步降低）90100%（接种（接种BCG者的特者的特异性不变）异性不变）与与BCG的交叉反应的交叉反应存在存在存在的可能性较小存在的可能性较小与与NTM的交叉反应的交叉反应存在存在存在的可能性较小存在的可能性较小与与M.TB暴露的相关性暴露的相关性存在存在相关性较相关性较PPD皮试大皮试大阳性结果与随访期间罹阳性结果与随访期间罹患结核的相互关系患结核的相互关系中到显著的正相关中到显著的正相关无充足

22、的证据无充足的证据可重复性可重复性中等，但可变中等，但可变较高，但证据较少较高，但证据较少 PPD皮试和T-SPOTT-SPOT试验的比较34T-SPOT试验结果解释 阴性阴性结果果提示患者体内不存在提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效核杆菌特异的效应T细胞。假阴性胞。假阴性结果：果：感染感染阶段不同；段不同；少数免疫系少数免疫系统功能不全功能不全/疾病；疾病；实验非正常操作。非正常操作。阳性阳性结果果提示患者体内存在提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效核杆菌特异的效应T细胞，患者存在胞，患者存在结核感染。但核感染。但是否是活是否是活动性性结核病，需核病，需结合合临床症状和其它床症状和其它检

23、测指指标综合判断。假阳性合判断。假阳性结果：果：4种种环境分枝杆菌感染境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪（堪萨斯）、斯）、M.szulgai（苏氏）、氏）、M.marinum（海）、（海）、M.gordonae（戈登）（戈登）减少了医生主减少了医生主观因素因素对检测结果的影响果的影响;故故虽然然检测仪器昂器昂贵，操作相，操作相对较为复复杂，但仍可，但仍可视为进行行结核病早期核病早期诊断的断的较为理想的手段。理想的手段。35非血液样本检测T-SPOT可通过一些体液成功地诊断出活动性结核：支气管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部）脑脊髓液（“CSF”）（中枢神经系统）胸腔积液（肺部周围）腹膜液

24、（腹腔）非血样本的T-SPOT结果很强的话（即存在大量的结核效应T细胞）,揭示在这个器官或部位存在活动性结核非血样本中不存在结核效应T细胞，说明这个器官或部位没有活动性结核36各国对潜伏感染风险人群的筛查指南风险人群风险人群美国指南美国指南加拿大指南加拿大指南英国指南英国指南免疫力抑制人群（例如，免疫力抑制人群（例如，HIV感染者，使用强的松感染者，使用强的松或或TNF-抑制剂治疗）抑制剂治疗）TST或或IGRA；如果是；如果是阴性或高度怀疑的，阴性或高度怀疑的，TST和和IGRA都要检查都要检查TST，如果，如果TST阴性要用阴性要用IGRA确认确认TST或或IGRABCG接种者（如果也属于

25、接种者（如果也属于其它风险人群）其它风险人群）推荐用推荐用IGRA没有特定的推荐没有特定的推荐TST或或IGRA与传染性肺结核患者密切与传染性肺结核患者密切接触接触TST或或IGRATST，用，用IGRA进一步确进一步确认认TST阳性阳性TST，用，用IGRA进一步确认进一步确认TST阳性阳性医务工作者医务工作者TST或或IGRA推荐用推荐用TSTTST或或IGRA，视情况而定，视情况而定无法再来确认无法再来确认TST结果的结果的人群（例如，流浪汉，注人群（例如，流浪汉，注射吸毒者或交通不方便）射吸毒者或交通不方便）推荐用推荐用IGRA没有特定的推荐没有特定的推荐推荐用推荐用IGRA37小结0

26、3小结39参考文献1.韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健韦海旭，席薇莲，陆利欢，陈健.-干扰素释放分析干扰素释放分析T-SPOTTB在结核性疾病中的诊断价值在结核性疾病中的诊断价值.临床肺科杂志临床肺科杂志.2012,17(8):1439-1440 2.张丽帆，刘晓清张丽帆，刘晓清.干扰素释放分析干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核感染临床应用进展诊断结核感染临床应用进展.中国医学科学院学报中国医学科学院学报.2009,4:506-5103.中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，中华人民共和国卫生部，肺结核诊断标准，2008-08-01 4.Childhood tuberculosis trea

27、tment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.5.Connell et al PLoS ONE 2008.3;7:e26246.Kobashi et al.Scand J Infect Dis 2008.40;8:629-347.Dominguez et al Clin Vacc.Immunol 2008;15;168-718.Kim et al.Am J Med.2009；122,189-19540Thank you请请各位老各位老各位老各位老师师批批批批评评指正！指正！指正！指正！