《酶联免疫分析法》PPT课件.ppt

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1、第第七章七章 酶联免疫分析法酶联免疫分析法第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法基本要求：基本要求：了了解解免免疫疫分分析析发发展展史史，掌掌握握抗抗原原、抗抗体体和和免免疫疫反反应应的的原原理理，了了解解免免疫疫分分析析法法的的分分类类，熟熟悉悉酶酶标标记记免免疫疫分分析析法法中中使使用用的的酶酶，熟熟悉悉ELISAELISA的的原原理理，掌掌握握ELISAELISA的的固固相相载载体体、包包被被与与封封闭闭、稀稀释释液液、洗洗涤涤液液、酶酶反反应应终终止止液液及及ELISAELISA法法常常用用酶酶的的底底物物系系统统，掌掌握握ELISAELISA的的酶酶联联方方法法和和试试验验方方法

2、法，熟熟悉悉ELISAELISA反反应应条条件件的的选选择择，掌掌握握ELISAELISA的的定定量量计计算算，了了解解ELISAELISA的的灵灵敏敏度度提提高高途途径径，熟熟悉悉ELISAELISA放放大大系系统统。了了解解化化学学发发光光分分析析的的原原理理，熟熟悉悉化化学学发发光光剂剂的的种种类类，熟熟悉悉化化学学发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析常常用用的的标标记记酶酶和和发发光光增增强强剂剂，熟熟悉悉生生物物发发光光酶酶联联免免疫疫分分析析常常用的生物发光反应体系。用的生物发光反应体系。第第七七章章 酶联免疫分析酶联免疫分析法法第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二

3、节 光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析第三节第三节 发光酶联免疫分析发光酶联免疫分析第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述一、一、免疫分析免疫分析1 1、免疫分析发展史、免疫分析发展史免免疫疫分分析析（ImmunoassayImmunoassay，IAIA）是是利利用用待待测测物物质质（抗抗原原或或抗抗体体）与与其其相相对对应应物物质质（抗抗体体或或抗抗原原）之之间间专专一一特异性反应特异性反应而建立起来的一种而建立起来的一种高选择性高选择性分析方法。分析方法。免免疫疫分分析析主主要要基基于于用用抗抗体体（或或抗抗原原）作作为为选选择择性性化化学学试剂以分析试剂以分析测定抗原测定抗原（或

4、抗体）及（或抗体）及半抗原半抗原。宋代宋代 人工痘苗人工痘苗预防烈性传染病天花预防烈性传染病天花19711971年年 第第一一届届国国际际免免疫疫学学会会议议 将将免免疫疫学学与与微微生生物物学分开发展成一门独立的学科。学分开发展成一门独立的学科。“免免疫疫（immunityimmunity）”一一词词源源于于 “immunitasimmunitas”，原原意是免除税赋和差役。意是免除税赋和差役。研究早期免疫学多集中在研究早期免疫学多集中在抗体抗感染能力抗体抗感染能力研究。研究。2020世世纪纪中中期期以以后后，人人们们逐逐渐渐开开始始对对各各种种抗抗原原、微微生生物物的的作作用用进进行行研研

5、究究，发发展展出出基基础础免免疫疫学学、临临床床免免疫疫学学、免疫学检测、医学免疫学等多个分支。免疫学检测、医学免疫学等多个分支。现现代代免免疫疫学学将将“免免疫疫”定定义义为为：机机体体对对“自自己己”和和“异异己己”识识别别、应应答答过过程程中中所所产产生生的的生生物物学学效效应应的的总总和和，正常情况下是正常情况下是维持内环境稳定维持内环境稳定的一种生理性功能。的一种生理性功能。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、抗原、抗体与免疫反应、抗原、抗体与免疫反应抗原抗原是能够引起免疫反应的分子。是能够引起免疫反应的分子。免免疫疫原原性性（immunogenicityimmun

6、ogenicity）指指诱诱导导刺刺激激免免疫疫系系统统产产生抗体或致敏淋巴细胞的能力生抗体或致敏淋巴细胞的能力。具有免疫原性的物质称为具有免疫原性的物质称为免疫原免疫原（immunogenimmunogen）。免免 疫疫 反反 应应 原原 性性（immunoreactivityimmunoreactivity）或或 抗抗 原原 性性（antigenicityantigenicity），指指能能与与相相应应抗抗体体或或致致敏敏淋淋巴巴细细胞胞发生特异性结合，引起免疫反应的性能。发生特异性结合，引起免疫反应的性能。具具备备上上述述两两种种特特性性的的物物质质为为完完全全抗抗原原，仅仅具具有有免免

7、疫疫反反应性的物质被称为应性的物质被称为半抗原半抗原（haptenhapten）。）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述抗体抗体是能与抗原发生特异性结合的是能与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白免疫球蛋白。所所有有的的抗抗体体都都是是免免疫疫球球蛋蛋白白，但但并并非非所所有有的的免免疫疫球球蛋蛋白都是抗体白都是抗体。例例如如无无免免疫疫活活性性的的免免疫疫球球蛋蛋白白（如如骨骨髓髓瘤瘤蛋蛋白白）就就不不是抗体，是抗体，尽管尽管其结构与抗体相似。其结构与抗体相似。抗抗体体主主要要存存在在于于血血清清内内，但但在在其其他他体体液液及及外外分分泌泌液液中中也有存在。也有存在。抗抗原原抗抗体体

8、分分子子之之间间存存在在着着结结构构互互补补性性和和亲亲和和性性，使使得得抗抗原原与与相相应应抗抗体体之之间间极极易易发发生生结结合合反反应应，这这种种反反应应具具有有高特异性高特异性（即专一性即专一性）和）和可逆性可逆性。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述抗原、抗体发生如下免疫反应：抗原、抗体发生如下免疫反应：Ag+Ab Ag-AbAg+Ab Ag-Ab该该免免疫疫反反应应遵遵循循可可逆逆生生物物大大分分子子相相互互作作用用的的热热动动力力学学基本原理，其反应式为基本原理，其反应式为式式中中：AbAb为为游游离离的的抗抗体体结结合合位位点点的的浓浓度度；AgAg为为游游离离的的抗

9、抗原原结结合合位位点点的的浓浓度度；Ab-AgAb-Ag为为抗抗原原-抗抗体体复复合合物物的的浓浓度度；k k1 1为为正正反反应应速速率率常常数数；k k2 2为为负负反反应应速速率率常常数；数；K K为为反应平衡常数反应平衡常数（亲和常数亲和常数）。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述这这种种抗抗原原-抗抗体体反反应应既既可可发发生生于于体体内内（in in vivovivo），也也可发生于体外（可发生于体外（in vitroin vitro）。）。抗抗体体主主要要存存在在于于血血清清中中，在在抗抗原原、抗抗体体的的检检测测中中多多采采用用血血清清做做试试验验，所所以以体体外外抗

10、抗原原-抗抗体体反反应应也也称称为为血血清清学反应学反应（serologic reactionserologic reaction）。）。基基于于抗抗原原-抗抗体体反反应应的的检检测测技技术术主主要要应应用用于于以以下下几几个个方面：方面：用已知抗原用已知抗原检测未知抗体检测未知抗体；用已知抗体用已知抗体检测未知抗原检测未知抗原；定性或定量定性或定量检测检测体内体内各种大分子物质各种大分子物质；用已知抗体用已知抗体检测检测某些药物、激素等各种某些药物、激素等各种半抗原半抗原物质。物质。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述二、二、酶标记免疫分析法及常用标记酶酶标记免疫分析法及常用标记酶

11、1 1、免疫分析法分类、免疫分析法分类第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述2 2、酶标记免疫分析法中使用的酶、酶标记免疫分析法中使用的酶（1 1）酶联免疫分析中使用的酶应）酶联免疫分析中使用的酶应符合下列条件符合下列条件：纯度高纯度高、催化反应的转化速率高、催化反应的转化速率高、专一性强专一性强；具有具有足够的足够的偶联用偶联用标记基团标记基团，与抗原、抗体蛋白分子，与抗原、抗体蛋白分子偶联后仍保持较高的催化活性；偶联后仍保持较高的催化活性；使用使用稳定性稳定性和保存稳定性和保存稳定性好好；测定测定酶活性的酶活性的方法简便方法简便、灵敏灵敏、快速快速；待测待测体液中不存在体液中不存在

12、与标记酶相同的酶；与标记酶相同的酶；第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述待测溶液中待测溶液中应该应该无底物无底物、反应抑制剂反应抑制剂和其他与酶发生和其他与酶发生反应的反应的干扰物质干扰物质；酶的来源、纯化和供应酶的来源、纯化和供应较方便较方便，价格，价格较低廉较低廉；均相酶免疫测定均相酶免疫测定法中使用的酶，还要求当抗体与半抗法中使用的酶，还要求当抗体与半抗原原-酶酶结合物结合结合物结合后，酶活性表现出后，酶活性表现出抑制或激活抑制或激活。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述（2 2）酶的评价指标酶的评价指标 通常通常用用RZRZ和和酶的比活酶的比活力评价力评价标记标记酶

13、的质量。酶的质量。RZRZ表示酶蛋白中表示酶蛋白中活性部分活性部分与与非活性部分非活性部分最大吸光度的最大吸光度的比值。比值。酶的比活酶的比活力力指在特定条件下，每指在特定条件下，每1mg1mg酶酶或或每每1ml1ml酶液所酶液所具有的酶活性单位数具有的酶活性单位数。（3 3）酶联免疫分析中的常用酶酶联免疫分析中的常用酶 下表下表列出了酶联免疫列出了酶联免疫分析中的常用酶。分析中的常用酶。其中其中ECEC编号编号是是根据国际酶学委员会根据国际酶学委员会的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。的规定采用四码编号法确定的每个酶的系统编号。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述酶酶来源来

14、源EC编号编号辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶辣根辣根1.11.1.7酸性磷酸酶酸性磷酸酶动植物动植物3.1.3.2碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛肠牛肠3.1.3.1-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶大肠杆菌大肠杆菌3.2.1.23葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶曲霉菌曲霉菌1.1.3.4脲酶脲酶Jack豆豆3.5.1.5青霉素酶青霉素酶3.5.2.6过氧化氢酶过氧化氢酶肝肝1.11.1.6葡萄糖淀粉酶葡萄糖淀粉酶根霉菌根霉菌3.2.1.3碳酸苷酶碳酸苷酶牛红细胞牛红细胞4.2.1.1乙酰胆碱酶乙酰胆碱酶3.1.1.7葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶肠系膜明串细菌肠系膜明串细菌1.1.1.49溶菌酶溶菌酶鸡卵白鸡卵

15、白3.2.1.17苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶猪心线粒体猪心线粒体1.1.1.49无机焦磷酸酶无机焦磷酸酶大肠杆菌大肠杆菌3.6.1.1荧光素酶荧光素酶发光生物发光生物1.3.12.7丙酮酸激酶丙酮酸激酶哺乳动物组织哺乳动物组织2.7.1.40酶联免疫分析常用酶酶联免疫分析常用酶第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（horseradish horseradish peroxidaseperoxidase，HRPHRP）是是一一种种提提取取自自辣辣根根中中，相相对对分分子子质质量量为为44kDa44kDa的的糖糖蛋蛋白白。其其酶酶学学活活性性部部分分包包括括脱脱

16、辅辅基基蛋蛋白白和和血血红红素素基基团团，辅辅基基亚铁血红素在亚铁血红素在403nm403nm波长呈现最大光吸收值。波长呈现最大光吸收值。HRPHRP的的纯纯度度以以RZRZ值值即即A A403nm403nm/A/A275nm275nm的的值值来来衡衡量量，高高纯纯度度HRPHRP制剂的制剂的RZ3.0RZ3.0。通通常常以以能能在在2020、pHpH为为6.06.0、20s20s的的时时间间内内催催化化底底物物邻邻苯苯三三酚酚产产生生1mg1mg红红桔桔酚酚（purpurogallinpurpurogallin）作作为为HRPHRP酶酶的的1 1个活性单位。个活性单位。用于标记的用于标记的H

17、RPHRP比活性应比活性应大于大于250U/mg250U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述碱碱性性磷磷酸酸酶酶（alkaline alkaline phosphatasephosphatase，APAP）几几乎乎存存在在于于动动物物和和人人体体的的所所有有组组织织中中，尤尤其其在在肝肝脏脏、胎胎盘盘、白白细胞、肾小管中含量高。细胞、肾小管中含量高。APAP是是一一种种磷磷酸酸酯酯的的水水解解酶酶，它它能能够够催催化化磷磷酸酸单单酯酯、磷磷酸酸核核苷苷及及6-6-磷磷酸酸糖糖类类等等的的水水解解，在在释释放放磷磷酸酸盐盐的的同同时时产生有色的或荧光的产物。产生有色的或荧光的产

18、物。碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的分分子子质质量量为为8080100kDa100kDa，最最适适pHpH为为8.08.010.010.0，随酶源和底物的不同而变化。，随酶源和底物的不同而变化。APAP活性的测定以活性的测定以对硝基磷酸苯酯对硝基磷酸苯酯（PNPPNP）作为底物。）作为底物。用作标记的用作标记的APAP比活比活力力应应大于大于1000U/mg1000U/mg。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶（glucose glucose oxidaseoxidase，GODGOD）即即-D-D-葡葡萄糖氧化还原酶，一般由黑曲霉和青霉产生萄糖氧化还原酶，一般由黑曲

19、霉和青霉产生。它它催催化化O O2 2和和-D-D-葡葡萄萄糖糖的的反反应应形形成成H H2 2O O2 2和和D-D-葡葡萄萄糖糖酸酸-内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。内酯，酯再与水反应生成葡糖酸。其其反反应应最最适适pHpH范范围围为为4.04.07.07.0，pH5.5pH5.5时时，反反应应速速率率最最大大。葡葡萄萄糖糖氧氧化化酶酶对对-D-D-葡葡萄萄糖糖的的-异异头头碳碳有有高高度专一性度专一性。葡萄糖氧化酶的比活葡萄糖氧化酶的比活力力至少为至少为20U/mg20U/mg。葡萄糖氧化酶在葡萄糖氧化酶在44下可稳定存在下可稳定存在6 61212个月。个月。第一节第一节 酶联免疫分析概述

20、酶联免疫分析概述-D-D-半半乳乳糖糖苷苷酶酶（-D-galactosidase-D-galactosidase，GalGal）即即乳乳糖糖酶酶（-lactase-lactase），广广泛泛存存在在于于植植物物、动动物物器器官官、细菌、酵母和真菌中。细菌、酵母和真菌中。当当GalGal催催化化水水解解-D-D-半半乳乳糖糖苷苷时时，若若得得到到的的半半乳乳糖糖残残基基转转移移到到水水分分子子受受体体，称称为为水水解解；若若受受体体是是糖糖或或醇醇时时，称为称为转半乳糖苷转半乳糖苷。GalGal催催化化-D-D-半半乳乳糖糖苷苷水水解解反反应应的的最最适适pHpH为为7.57.5，转转化化效效率

21、率很很高高，且且比比HRPHRP易易于于标标记记，背背景景值值低低，稳稳定定性性好。好。GalGal比活比活力力应不少于应不少于30U/mg30U/mg，55能保存能保存1 12 2年。年。第一节第一节 酶联免疫分析概述酶联免疫分析概述第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法一、一、光度酶联免疫分析光度酶联免疫分析1 1、酶酶联联免免疫疫吸吸附附分分析析（enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent immunosorbent assayassay，ELISAELISA）原理）原理使抗原或抗体使抗原或抗体结合结合到某种到某种固相载体表面固相载体表

22、面；抗原或抗体与某种酶联结成抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原酶标抗原或或抗体抗体；在在测测定定时时，使使受受检检标标本本和和酶酶标标抗抗原原或或抗抗体体按按不不同同的的步步骤骤与固相抗原与固相抗原或固相抗体起或固相抗体起反应反应；用用洗洗涤涤的的方方法法使使固固相相载载体体上上形形成成的的抗抗原原抗抗体体复复合合物物与与其其他他物物质质分分开开，结结合合在在固固相相载载体体上上的的酶酶量量与与标标本本中中受受检物质的量成检物质的量成一定的一定的比例比例；加加入入酶酶反反应应底底物物，底底物物被被酶酶催催化化为为有有色色产产物物，产产物物量量与与标本中标本中受检物受检物的的量相关量相关，用分光光

23、度法进行定量。，用分光光度法进行定量。*A Ag g是是酶酶标标志志抗抗原原，A Ag g是是未未标标志志抗抗原原，A Ab b是是特特异异性性抗抗体体，(F)(F)表示游离型的表示游离型的*A Ag g，(B)(B)表示结合型的表示结合型的*A Ag g-A Ab b。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA的固相载体的固相载体良良好好的的ELISAELISA板板应应该该是是吸吸附附性性能能好好，空空白白值值低低，孔孔底底透明度高透明度高，各板之间、同一板各孔之间，各板之间、同一板各孔之间性能相近性能相近。最常用的是最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯。聚聚氯氯乙

24、乙烯烯对对蛋蛋白白质质的的吸吸附附性性能能比比聚聚苯苯乙乙烯烯高高，但但空空白白值也略高。值也略高。ELISAELISA载体的形式有载体的形式有小试管小试管、小珠小珠和和微量反应板微量反应板。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、固相载体的包被与封闭、固相载体的包被与封闭（1 1）包包被被（coatingcoating）指指将将抗抗原原或或抗抗体体连连接接到到固固相相载载体体上的过程。上的过程。以以聚聚苯苯乙乙烯烯微微量量反反应应板板为为例例，通通常常先先将将抗抗原原或或抗抗体体溶溶于于pH pH 9.69.6的的碳碳酸酸盐盐缓缓冲冲液液（或或pH pH 7.27.2的的磷

25、磷酸酸盐盐缓缓冲冲液液，pH pH 7 78 8的的Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液）中中，加加满满反反应应孔孔，置置44过夜过夜，洗涤即可。，洗涤即可。包包被被浓浓度度随随载载体体和和包包被被物物的的性性质质可可有有很很大大的的变变化化，每每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为一般蛋白质的包被浓度为0.10.120g/ml20g/ml。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）封封闭闭（blockingblocking）指指继继包包被被之之后后用用高高浓浓度度的的无无关关蛋白质蛋白质溶液溶液再

26、包被再包被的过程。的过程。封封闭闭就就是是让让大大量量不不相相关关的的蛋蛋白白质质充充填填这这些些空空隙隙，从从而而排斥排斥ELISAELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。所有的所有的ELISAELISA固相载体均需封闭固相载体均需封闭。常常用用封封闭闭剂剂有有0.05%0.05%0.5%0.5%BSABSA；10%10%小小牛牛血血清清或或1%1%明明胶胶；脱脂奶粉脱脂奶粉，比较价廉，可高浓度使用（，比较价廉，可高浓度使用（5%5%）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法4 4、稀释液、洗涤液和酶反应终止液、稀释液、洗涤液和酶反应终止液（1 1）

27、稀释液稀释液用于稀释酶标抗体及标本。用于稀释酶标抗体及标本。常常用用中中性性PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲冲液液，其其中中含含有有无无关关高高浓浓度度蛋蛋白白（如如1010动动物物血血清清、1 1BSABSA（牛牛血血清清白白蛋蛋白白）、1 1明明胶胶等等）和和非非离离子子型型表表面面活活性性剂剂（如如0.050.05Tween Tween 2020或或TritonX-100TritonX-100等）。等）。（2 2）洗洗涤涤液液一一般般与与稀稀释释液液相相同同，常常用用PBSPBS或或Tris-HClTris-HCl缓缓冲液。冲液。四四种种常常用用的的抗抗体体稀稀释释

28、液液和和三三种种常常用用的的洗洗涤涤液液列列于于表表7-7-2 2。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法编编号号吐温吐温20/%组成组成稀稀释释液液10.05PBS 0.01mol/L，pH 7.42PBS 0.05mol/L，pH 7.43PBS 0.05mol/L，pH 7.4，含，含EDTA 10mmol/L4PBS 0.05mol/L，pH 6.9，含，含EDTA 10mmol/L洗洗涤涤液液10.1PBS 0.01mol/L，pH 7.22PBS 0.01mol/L，pH 8.03Tris-HCl缓冲液缓冲液0.01mol/L，pH 8.0，NaCl 0.15mol/L

29、表表7-2 常用的抗体稀释液和洗涤液常用的抗体稀释液和洗涤液第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）酶反应终止液）酶反应终止液 辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（HRPHRP）反反应应终终止止液液为为2mol/L2mol/L4mol/L 4mol/L H H2 2SOSO4 4（HRPHRP在酸性条件下丧失酶活性）。在酸性条件下丧失酶活性）。很很多多ELISAELISA试试剂剂采采用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶（APAP）作作为为标标记记酶酶，用用3mol/L NaOH3mol/L NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一终止酶反应后，黄色可稳定一段段时间。时间。第二节第二节 酶联免疫吸附

30、分析法酶联免疫吸附分析法5 5、ELISAELISA法常用酶的底物系统法常用酶的底物系统ELISAELISA法法对底物的要求对底物的要求：价廉易得价廉易得、安全安全；显色性显色性和和稳定性稳定性好好；底物底物本身最好本身最好为为无色无色物质物质；终止终止酶催化反应后酶催化反应后，底物底物不应再不应再继续地继续地自发性变性自发性变性；其最终其最终产物可溶产物可溶、易于测定易于测定及及光吸收值高光吸收值高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1）辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻苯苯二二胺胺（OPDOPD，产产物物橙橙红红色色，测测定定波

31、波长长492nm492nm）、5-5-氨氨基基水水杨杨酸酸（5-AS5-AS，产产 物物 橙橙 色色，测测 定定 波波 长长 550nm550nm）、3,3,5,5-3,3,5,5-四四甲甲基基联联苯苯胺胺（TMBTMB，产产物物红红色色，测测定定波波长长450nm450nm）、2,2-2,2-连连氮氮-二二（3-3-乙乙基基苯苯并并噻噻唑唑啉啉-6-6-磺酸盐磺酸盐）（）（ABTSABTS）等。）等。ABTSABTS的的反应曲线不好反应曲线不好。OPDOPD溶溶液液具具有有光光敏敏性性，相相对对来来说说不不稳稳定定，且且具具有有诱诱变变特性特性。TMBTMB的的背景值低背景值低，溶液，溶液稳

32、定稳定，没有诱变没有诱变特性。特性。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的底底物物系系统统 常常用用的的底底物物为为对对硝硝基基磷磷酸酸苯苯酯酯（PNPPNP），水水解解的的产产物物为为黄黄色色的的对对硝硝基基苯苯酚酚，可可在在405nm405nm处处检检测测其其吸吸光光度度的的变变化化，该该底底物物的的转转化化效效率高，线性关系好率高，线性关系好。用用酚酚酞酞磷磷酸酸酯酯为为底底物物，水水解解生生成成的的酚酚酞酞在在碱碱性性条条件件下下呈红色，可在呈红色，可在530nm530nm处光度法测定处光度法测定。此外还可以此外还可以百里酚酞单磷酸酯百里酚

33、酞单磷酸酯等等为为底物。底物。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）-D-D-半半乳乳糖糖苷苷酶酶的的底底物物系系统统 常常见见底底物物有有邻邻硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（ONPGONPG），其其水水解解的的产产物物邻邻硝硝基基苯苯酚在酚在405nm405nm处具有最大吸光度值处具有最大吸光度值。其其他他的的底底物物有有对对硝硝基基苯苯-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（PNPGPNPG）、苯苯基基-D-D-半半乳乳糖糖苷苷、氯氯酚酚红红-D-D-半半乳乳糖糖苷苷（CPRGCPRG）、9-9-羟基羟基-3-3-异吩噁唑酮异吩噁唑酮-D-D-半乳糖苷半乳糖苷（RGRG）

34、等。）等。（4 4）青青霉霉素素酶酶（PNCPNC）的的底底物物系系统统 常常用用底底物物有有溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（BTBBTB）、青青霉霉酮酮酸酸还还原原淀淀粉粉-碘碘复复合合物物（SICSIC）、溴溴甲甲酚酚紫紫（BCPBCP）和和溴溴麝麝香香草草酚酚蓝蓝（2 21 1）等。等。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法二、二、ELISAELISA酶联方法和试验方法酶联方法和试验方法1 1、ELISAELISA酶联方法酶联方法ELISAELISA酶联方法主要有两种，即酶联方法主要有两种，即戊二醛交联法戊二醛交联法和和过碘过碘酸盐氧化法酸盐氧化法。（1 1）戊二醛交联法戊二醛交联

35、法 戊二醛是一种双功能团试剂，戊二醛是一种双功能团试剂，它可以它可以联结具有氨基的酶和蛋白质联结具有氨基的酶和蛋白质。戊二醛交联法有戊二醛交联法有一步法一步法、两步法两步法两种。两种。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-2 戊二醛一步法反应原理戊二醛一步法反应原理一一步步法法 将将戊戊二二醛醛直直接接加加入入酶酶与与抗抗体体的的混混合合物物中中，反反应应后后即即得得酶酶标标记记抗体。抗体。该该法法操操作作简简便便、有有效效，重复性好重复性好。缺缺点点是是交交联联反反应应是是随随机机的的，酶酶与与酶酶、抗抗体体与与抗抗体之间有可能交联。体之间有可能交联。第二节第二节 酶联免

36、疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-3 戊二醛二步法反应原理戊二醛二步法反应原理两两步步法法 先先将将酶酶与与戊戊二二醛醛作作用用，透透析析除除去去多多余余的的戊戊二二醛醛后后，再再与与抗抗体体作作用用而而形形成成酶酶标标抗抗体体；或或先先将将抗抗体体与与戊戊二二醛醛作作用用，再与酶联结。再与酶联结。两两步步法法的的产产物物中中绝绝大大部部分分的的酶酶与与蛋蛋白白质质是是以以1:1的的比比例例结结合合的的，有有助助于于本底的改善本底的改善。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）过碘酸盐氧化法）过碘酸盐氧化法 本法只适用于本法只适用于含糖量较高含糖量较高的酶。的酶。辣根过

37、氧化物酶辣根过氧化物酶（HRPHRP）的标记常用此法。）的标记常用此法。反反应应时时，过过碘碘酸酸钠钠将将HRPHRP分分子子表表面面的的多多糖糖氧氧化化为为活活泼泼的的醛基醛基，可与蛋白质上的氨基形成，可与蛋白质上的氨基形成SchiffSchiff氏碱氏碱而结合。而结合。图图7-4 7-4 过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、ELISAELISA试验方法试验方法ELISAELISA法中有三个必要试剂：法中有三个必要试剂：固相抗原固相抗原或抗体；或抗体；酶标记抗原酶标记抗原或抗体；或抗体；酶反应底物酶反应底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测

38、的具体条件，根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。如如双抗体夹心法双抗体夹心法、间接法间接法、竞争法竞争法、异种动物抗体双异种动物抗体双夹心法夹心法、抗酶抗体法抗酶抗体法、竞争性抑制法竞争性抑制法、双夹心法双夹心法和和抗抗原直接包被法原直接包被法等方法。等方法。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（1 1）双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwichdouble antibody sandwich，DAS-DAS-ELISAELISA）由）由ClarkCl

39、ark和和AdamsAdams于于19771977年建立，是最经典的年建立，是最经典的ELISAELISA检测法检测法。该法的该法的灵敏度高灵敏度高，特异性强特异性强，但提纯免疫球蛋白和制，但提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求备酶标记物要求技术性强技术性强，成本较高成本较高。该法该法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析定量分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。，而不能用于半抗原等小分子的测定。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-5 双抗体夹心法双抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（2 2）间接

40、法间接法间间接接法法（indirect indirect ELISAELISA）是是最最常常用用的的ELISAELISA检检测测方方法法，其其原原理理是是利利用用酶酶标标记记的的抗抗体体和和已已与与固固相相抗抗原原结结合合的受检的受检抗体抗体相结合。相结合。该该法法只只要要更更换换不不同同的的固固相相抗抗原原，就就可可以以用用一一种种酶酶标标抗抗抗体检测抗体检测各种与抗原相应的抗体。各种与抗原相应的抗体。该该方方法法不不必必为为每每个个待待测测抗抗体体（或或抗抗原原）制制备备特特异异性性的的酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地酶标抗抗体（或酶标抗体），极大地简化简化了实验。了实验。第二节第二节 酶

41、联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-6 间接法间接法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（3 3）竞争法竞争法竞竞争争法法（competing competing ELISAELISA）是是利利用用待待测测抗抗原原和和酶酶标标抗抗原原与与特特异异性性抗抗体体竞竞争争结结合合，或或待待测测抗抗体体和和酶酶标标抗抗体体与与特特异异性性抗抗原原竞竞争争结结合合而而进进行行测测定定的的一一种种方方法法（图图7-7-7 7）。）。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-7 竞争法竞争法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（4 4）异种动物抗体双夹心法异

42、种动物抗体双夹心法异异种种动动物物抗抗体体双双夹夹心心法法（图图7-87-8），又又称称间间接接双双抗抗体体夹夹心心法法（indirect indirect DAS-ELISADAS-ELISA）或或三三抗抗体体夹夹心心法法（triple antibodies sandwichtriple antibodies sandwich，TAS-ELISATAS-ELISA）。）。此此法法可可用用通通用用的的酶酶标标记记抗抗体体检检验验多多种种病病毒毒，它它不不仅仅免免去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。去了标记每种抗体，而且灵敏度有所提高。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-

43、8 异种动物抗体夹心法异种动物抗体夹心法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法（5 5）抗酶抗体法抗酶抗体法抗抗酶酶抗抗体体法法（图图7-97-9）是是利利用用免免疫疫学学反反应应而而不不是是用用化化学学交交联联反反应应来来制制备备酶酶结结合合物物，常常用用HRPHRP为为标标记记酶酶作作为为抗原抗原免疫动物制备抗免疫动物制备抗HRPHRP抗体抗体。可可用用一一种种动动物物（如如兔兔）制制备备特特异异性性抗抗体体（第第一一抗抗体体）和和抗抗酶酶抗抗体体（第第三三抗抗体体），再再用用另另一一种种动动物物（如如羊羊）制备制备抗第一种动物抗第一种动物（兔）（兔）IgGIgG的抗体的抗体（

44、第二抗体）。（第二抗体）。让让这这种种抗抗IgGIgG的的第第二二抗抗体体把把第第一一抗抗体体（兔兔IgGIgG）和和抗抗酶酶抗体抗体（也为兔（也为兔IgGIgG）通过免疫学反应连接起来。）通过免疫学反应连接起来。最最后后让让酶酶与与抗抗酶酶抗抗体体结结合合，通通过过对对底底物物的的作作用用而而揭揭示示在固相载体上待测抗原的存在。在固相载体上待测抗原的存在。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法优优点点:HRP:HRP通通过过免免疫疫学学反反应应与与抗抗体体结结合合，避避免免了了用用化化学学方方法法交交联联时时抗抗体体活活性性的的改改变变，也也避避免免了了HRPHRP与与其其他他蛋

45、蛋白白质质分分子子结结合合，防防止止标标记记抗抗体体和和游游离离的的未未标标记记抗抗体体之之间的间的竞争竞争，提高了标记抗体的质量提高了标记抗体的质量。在在纯纯化化化化学学交交联联反反应应制制备备的的酶酶结结合合物物的的过过程程中中，除除去去未未标标记记抗抗体体比比较较困困难难，而而且且该该法法仅仅在在制制备备抗抗酶酶抗抗体体时时用用少少量量纯纯HRPHRP作作抗抗原原，所所以以用用较较粗粗制制的的HRPHRP与与抗抗酶酶抗抗体体形形成成免免疫疫复复合合物物，并并不不影影响响其其质质量量，这这大大大大节节约约了了价价格较昂贵的精制格较昂贵的精制HRPHRP。因因为为制制备备抗抗酶酶抗抗体体必必

46、须须在在动动物物中中进进行行，故故抗抗酶酶抗抗体体法法多多适用于检测动物中的抗体适用于检测动物中的抗体。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法图图7-9 抗酶抗体法抗酶抗体法第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法三三、ELISA反反应应条条件件的的选择选择1 1、酶标抗体浓度的选择、酶标抗体浓度的选择先先用用200200L L IgGIgG（100 100 mg/mlmg/ml）包包被被小小孔孔，再再将将酶酶标标记记抗抗体体球球蛋蛋白白系系列列稀稀释释并并加加入入小小孔孔中中，洗洗涤涤后后，加加底底物物反反应应，终止终止后后测定测定吸光度。吸光度。选选择择吸吸光光度度为

47、为1 1的的稀稀释释度度作作为为酶酶标标抗抗体体最最适适浓浓度。度。图图7-10 酶标抗体浓度的选择酶标抗体浓度的选择第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法2 2、包被浓度的选择、包被浓度的选择当包被抗原的当包被抗原的浓度较浓度较低时低时，包被量，包被量随随抗原抗原浓度的增加浓度的增加而而增大增大；当包被抗原当包被抗原达到一定达到一定浓度后浓度后，包被量为定包被量为定值值，不再随抗原浓度，不再随抗原浓度的增加而增大的增加而增大。此浓度称为此浓度称为抗原的饱抗原的饱和包被浓度和包被浓度。图图7-11 抗原包被量和抗原包被量和ELISA反应的关系反应的关系 第二节第二节 酶联免疫吸附分

48、析法酶联免疫吸附分析法表表7-3 SM-EDA-GA7-3 SM-EDA-GA包被法中链霉素包被质量浓度对包被法中链霉素包被质量浓度对ELISAELISA实验误差的影响实验误差的影响包被质量浓度（包被质量浓度（mg/mlmg/ml）ELISAELISA测定结果测定结果（A A492492SDSD）（）（n n=4=4）4 41.0980.06281.0980.06281*1*1.0110.03021.0110.03020.50.50.9690.08760.9690.08760.250.250.7920.10230.7920.1023第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶联免疫吸附分析法3 3、酶、

49、酶-底物反应时间的选择底物反应时间的选择抗抗原原与与抗抗体体、抗抗体体与与酶酶标标抗抗体体反反应应一一般般在在3737反反应应2 23h3h达到高峰。达到高峰。时时间间太太短短，敏敏感感性性下下降降，时时间间太太长长，吸吸附附的的抗抗原原或或复复合物（在这个温度下）可能脱落。合物（在这个温度下）可能脱落。酶酶-底底物物反反应应时时间间一一般般采采用用15min15min、30min30min或或45min45min，也也可可以以标标准准阳阳性性血血清清为为准准，随随时时测测定定其其ODOD值值，当当达达到到规规定的定的ODOD值时，即终止反应值时，即终止反应。第二节第二节 酶联免疫吸附分析法酶

50、联免疫吸附分析法四、四、ELISAELISA的定量计算与灵敏度的定量计算与灵敏度1 1、ELISAELISA的定量计算的定量计算一一般般采采用用分分光光光光度度计计测测定定结结合合物物中中的的酶酶量量和和抗抗体体蛋蛋白白（IgGIgG）量，酶量和）量，酶量和IgGIgG计算方法如下。计算方法如下。其其中中，0.40.4表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，酶酶量量为为0.4mg/ml0.4mg/ml；0.420.42表表示示酶酶的的A A403nm403nm值值为为1 1时时，其其相相应应A A280nm280nm值值为为0.420.42；0.620.62表表示示在在A