《载体构建流程》PPT课件.ppt
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1、经典载体构建流程I 载体构建流程 cDNA 提取提取mRNA得到目的基因得到目的基因 RT PCR PCR产物纯化产物纯化 酶切目的基因和载体酶切目的基因和载体 纯化酶切产物纯化酶切产物 连接连接 转化转化 菌落菌落PCR 挑取阳性克隆去测序挑取阳性克隆去测序 测序正确的摇菌提质粒测序正确的摇菌提质粒 保菌保菌导入表达宿主导入表达宿主测试表达情况测试表达情况提取提取mRNAn如果可能,实验室应辟出专门RNA操作区,离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁,并定期进行消毒。.操作过程中应自始至终佩戴口罩和手套,并经常更换,以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试
2、管或污染用具。操作过程所用器材都要经过特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180,4h。RTn由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开来的断裂基因,若以基因组为模板PCR得到的片段克隆进载体,不能在原核细胞剪接内含子,也不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要克隆真核蛋白基因,需以不含内含子的连续编码的mRNA为模板。nPCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增,必须通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA为模板扩增目的基因。n根据不同的目的,可有三类引物选择PCR得到目的基因 刚开始摸条件时,都会先做一个梯度PCR,选出最适条件。由于
3、此步为获取正确的目的基因,所以尽量避免PCR的突变格外重要。其中所采取的措施有:使用高保真酶、循环次数控制在300cycle左右、引物设计合理等。1234522557294时间(min)温度()适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR常出现的问题 n1.假阳性:出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高 2.出现非特异性扩增带:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有解决方法n假
4、阳性的原因及解决方法假阳性的原因及解决方法:可能引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染。n非特异性条带的出现非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当
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