CR技术极其应用.ppt

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1、分子生物学与临床 中中 山山 大大 学学 主讲：杨主讲：杨 中中 汉汉（）（）目 录PCR的概念 PCR技术的创建PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction)Polymerase:DNA聚合酶 基因组基因组DNADNA引物引物DNADNA聚合酶聚合酶DNA片段体外扩增PCRPCR技术的创建技术的创建Kary B.MullisKary B.Mullis（穆利斯（美）（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。1983年,Mullis发

2、明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。Kary B.Mullis（1944）http:/三篇重要论文The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction(Scientific American,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA

3、with a Thermostable DNA Polymerase(Science,1988,239(4839):487-91)Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction(Methods in Enzymology,1987,155:335-50)生物样品生物样品生物样品生物样品DNADNA片段片段基基基基因因因因诊诊诊诊断断断断基基基基因因因因治治治治疗疗疗疗基基基基因因因因工工工工程程程程产产产产品品品品法法法法医医医医学学学学检检检检测测测测人人人人类类类类学学学学研研研研究究

4、究究PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要基因组基因组基因组基因组DNADNA获取特定获取特定获取特定获取特定DNADNA片段片段片段片段扩扩扩扩增增增增特特特特定定定定D DNNA A片片片片段段段段限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解限制性内切酶裂解基因组基因组基因组基因组DNADNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装基因组基因组DNADNA文库文库DNA文库文库20kB fragments插入噬菌体载体细菌扩增裂解裂解变性变性显影从基因组文库中筛选目的基因从基因组文库中筛选目的基因probeDNA克隆克隆目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增

5、扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子DNADNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物引物引物引物引物M13M13噬菌体噬菌体Sanger的测序技术引物引物DNADNA聚合酶聚合酶1977年引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNA片段片段片段片段1983年94949494变性变性变性变性50-6550-65退火退火退火退火XX延伸延伸延伸延伸9494949455553737Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶酶酶活活活活性性性性(%)温度温度温度温度()40 50 60 70 80 90

6、100100 80 60 40 207272949494945555PCRPCR循环循环循环循环PCR技术的原理1 PCR技术的基本原理 无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。体内DNA的复制DNA聚合酶 dNTPdNTP解旋酶类解旋酶类引物复习复习5 5 33加热加热变变 性性复复性性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使 DN

7、A双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物引物引物引物延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸延伸5 55 53 33 3变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火2 PCR技术的特点1）高度的灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR产物每轮循环增加一倍2）特异性引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特

8、异性扩增。引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。3355355限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变定点突变定点突变探针标记探针标记探针标记探针标记3）操作简便易行 PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA 扩增法是分子克

9、隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。目的基因目的基因载体载体复制子复制子宿主细胞宿主细胞扩增扩增扩增扩增提取提取提取提取DNADNA分子分子分子分子4）用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR的反应体系和方法 PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,

10、每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 1 反应体系PCR技术的基本过程(1)模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer预变性预变性模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBufferTaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶9494oC5

11、2 基本过程PCR技术的基本过程(2)Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer循循环环仪仪949455 55 72 72 Taq Taq 酶酶酶酶模板模板模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物引物引物BufferBuffer72 572 57 min7 min琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR技术的基本过程(3)1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PC

12、R反应条件（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2

13、+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数(1)变性 (2)使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加经典循环参数（500bp以内）94 30s 94 30s 55 45s55 45s72 1min72 1min94 5min94 5m

14、in30次72 7min72 7min42 forever42 forever1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文

15、库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶3）多重PCR（复合（复合PCRPCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。电电电电泳泳泳泳引物引物12341234DMD：人类肌营养不良基因A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式多重PCR检测DMD基因缺失4）LP-PCR（Labelled primers)Labelled

16、primers)利用同位素、荧光素等对引物进行标记,用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分病毒病毒1 1 病毒病毒2 2 病毒病毒 3 3 病毒病毒4 4标记引物标记引物标记引物标记引物观察观察PCRPCR产物产物5）锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？（固定化PCR）VHVHCH1CH1CH1CH1CH2CH2CH2CH2CH3CH3CH3CH3VHVHVLVLVLVLCLCLCLCLcDNAcDNA末端核酸转移酶末端核酸

17、转移酶3GGGG3GGGG5 5 CCCC CCCC 锚定引物锚定引物3GGGG3GGGG5 5 CCCCCCCC3GGGG3GGGGCCCCCCCC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增6）PCR固相分析法模模板板生物素生物素化引物化引物PCRPCR扩增扩增探探针针亲和固亲和固相介质相介质检测探检测探针信号针信号可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作7）原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的

18、反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高,但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用

19、。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达8）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链9)9)荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对对PCRPCR产产物进行标物进行标 记跟踪记跟踪,实时在线监控反

20、应过程实时在线监控反应过程,结合相应结合相应的软件可以对结果进行分析的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板计算待测样品的初始模板量。量。荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量 PCRPCR仪仪仪仪 光定量光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的系统的PCRPCR仪仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。通常配有电脑系统及相应的分析软件。荧光标记荧光标记荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法标记方法标记方法标记方法 内掺式染料内掺式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特异性探针序列特异性探针TaqmanTaqm

21、an Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特异性探针引物特异性探针 AmplifluorAmplifluor(IntergenIntergen)5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I 5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISYBR-Green I Taqman探针3端Q荧光分子能够吸收5端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5端荧光分子发出的荧光,只能

22、检测到3端荧光分子的荧光信号,但当溶液中有PCR 产物(模板)时,探针与模板退火,即产生了适合于核酸外切酶活性的底物,从而激活Taq 酶的5外切酶活性,将探针5端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET,从而发出荧光,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递（荧光共振能量

23、传递（FRET Probe）RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe）RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（Molecular Beacon Probe）引物特异性探针（引物特异性探针（Amplisenor Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特异性探针（引物特异性探针（Amplifluor Probe）荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时荧光定量实时PCRPCR与普通与普通与普通与普通PCRPCR的比

24、较的比较的比较的比较 实时在线监控实时在线监控实时在线监控实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增能够实时地观察到产物的增加加,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了提高了PCRPCR反应反应的特异的特异性性 增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性增加定量的精确性全程监控全程监控,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便结果

25、分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便,无需跑胶无需跑胶无需跑胶无需跑胶全新全新4通道实时荧光定量通道实时荧光定量PCR仪仪 普通梯度普通梯度PCR仪仪PCRPCR技术的应用技术的应用1)1)基因克隆基因克隆重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段大肠杆菌大肠杆菌胰岛素胰岛素重组体+胰岛素胰岛素基因基因基因基因基因工程产品基因工程产品55Bam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IBam H IG GT TC CC CG GG GA AC CC CC CT TG GC CA AG GG GG GT TC CC CG GG GA

26、 AC CC CC CT TG GC CA AG GG GCCTGCCTGGGACGGACGTCCGTCCCAGGCAGG质粒质粒DNADNA目的基因目的基因限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2)基因检测A内源性病变基因内源性病变基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不平衡珠蛋白链合成不平衡A正常人正常人正常人正常人病病病病 人人人人正正正正常常常常病病病病人人人人ASOASO探针法探针法A A A AC C C CT T T TG G G GASOASOASOASO探针探

27、针探针探针正常正常正常正常病人病人病人病人PCR-ASO检测基因点突变:主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段,然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交探针杂交NC膜探针正常人突变纯合突变纯合子子突变杂合子突变杂合子PCR-RFLP法：限制性内切酶限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶正常正常正常正常突变突变突变突变电电泳泳 HLA系统基因分型 PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-PCR-SSPSSP3)基因配型 PCR-SSP1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8PCRPCR1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8引物特异性（序列特异性引物-PCR技术）4）基因鉴定女女性性男男性性Y Y引物引物PCR男性男性 女性女性法医学分析 个体识别、亲缘鉴定方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序PCR-VNTR多态性检测PCRPCR；电泳检测；电泳检测（VNTRVNTR：数目可变的串联重复序列）父父父父 父父父父 子子子子 母母母母 现 嫌1 嫌2 嫌3思考题:1)从PCR的基本原理和特点,论述其应用价值.