《各种PCR介绍》PPT课件.ppt

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1、聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)根据细胞分裂中根据细胞分裂中 DNA 半保留复制半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。片段的方法。PCRPCR工作原理工作原理以要扩增的要扩增的DNADNA分子为分子为模板模板，以一对与模板一对与模板55末端和末端和33末端互补的寡核甘末端互补的寡核甘酸片段为酸片段为引物引物4 4种种脱氧核糖核甘酸脱氧核糖核甘酸存在的条件下存在的条件下依赖依赖DNADNA聚合酶聚合酶的的酶促合成酶促合成反应反应。PCR PCR特异性特异性取决于取决于引物引物和模板和模板DNADN

2、A结结合特异性合特异性。体外体外(试试管中管中)扩扩增特异增特异DNADNA片段片段短短时时间间内即可将所需内即可将所需目的目的DNADNA片段片段扩扩增增至至100100万万倍以上倍以上PCRPCR技术技术特点特点 敏感度高、特异性强、产率高、敏感度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速重复性好、操作简便、快速PCRPCR体系基本组成体系基本组成模板模板DNADNA：（10102-52-5）拷贝拷贝dNTPdNTP底物：底物：2020020200umolumol/L/L特异性特异性引物：引物：0.10.5 0.10.5 umolumol/L/LDNADNA聚合酶：聚合酶：Klenow

3、Klenow T4 T4、T7 T7聚合酶聚合酶 TaqDNATaqDNA聚聚合合酶酶:耐耐热热稳稳定定性性、5-35-3聚聚合合酶酶活活性性及及3-53-5外切酶活性，可外切酶活性，可校正校正PCRPCR反应中某些单核甘酸的反应中某些单核甘酸的错配错配。含含MgMg2+2+的缓冲液：的缓冲液：Mg Mg2+2+能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.01.52.0mmolmmol/L/L，过量将增加非特异性条带的产生。过量将增加非特异性条带的产生。循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍反应分反应分三步三步：1 变性变性 denat

4、urationdenaturation：加热加热90-9590-95，模板，模板DNADNA双链解离形成双链解离形成单链单链DNADNA；2 2 退火退火 anneallingannealling：温度突然降低温度突然降低,引物与模板引物与模板DNADNA结合结合,40-6040-60,TmTm值值 4 4（G+CG+C）+2+2（A+TA+T）-5.-5.3 3 延伸延伸 extensionextension：TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶以以4 4dNTPdNTP为底物，在为底物，在MgMg2+2+存在存在 的条件下，的条件下，催化催化DNADNA合成合成。70-7570-75时间时

5、间-要扩增片段长度决定要扩增片段长度决定待扩增片段：待扩增片段：1000 bp引物引物 Tm 55DNA 模板变性模板变性:94,5分钟分钟;PCR 循环循环(30 次次):94,30秒秒;50,45秒秒;72,1分钟分钟;最终延伸最终延伸:72,10分钟分钟PCR 反应条件的设定反应条件的设定 PCRPCR产物的检测产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳；分子杂交；分子杂交；限制性内切酶酶切分析；限制性内切酶酶切分析；微孔板夹心杂交法；微孔板夹心杂交法；直接测序直接测序PCR 产物的检测产物的检测-琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳PCR 产物产物PCR 产物产物PCR 技术的应用技术的应用1

6、.基础研究基础研究(1)基因或基因或 cDNA 克隆克隆：从基因数据库中获得某一基因或：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核的核 苷酸序列，用苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或方法扩增并克隆该基因或 cDNA。(2)基因表达：基因表达：用用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学医学(1)感染性疾病感染性疾病病原体的诊断：病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2)遗传病相关基因遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3)恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断3.

7、基因动、植物的检测基因动、植物的检测(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。转基因植物的检测：玉米、大豆等。PCR新技术RT-PCRRT-PCR：用于用于RNARNA分析分析梯度梯度PCRPCR：可用于找出最适合的退火温度：可用于找出最适合的退火温度反向反向PCRPCR：可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析不对称不对称PCRPCR：用于制备单链用于制备单链DNADNA多多重重PCRPCR：加加上上二二对对以以上上引引物物，同同时时扩扩增增出出多多个个核核酸酸片段片段降降落落PCRPCR：

8、用用于于PCRPCR条条件件的的优优化化，避避免免非非特特异异性性序序列列的的扩增扩增 实时定量实时定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR)巢式巢式PCR：使用两对（而非一对）使用两对（而非一对）PCR引物扩增完引物扩增完整的片段整的片段反转录反转录 PCR(RT-PCR)RT-PCR 将以将以 RNA 为模板的为模板的 cDNA 合成合成同同 PCR 结合结合在一起，提在一起，提供了一种供了一种分析基因表达分析基因表达的快速灵敏的的快速灵敏的方法。方法。53AAAAA535335533553RT-PCR 原理原理mRNA1st cDNA逆转录酶、逆转录酶、

9、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特异特异 PCR 产物产物5533经经 30 个循环，产生个循环，产生 230 个分子拷贝个分子拷贝5533一步法一步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在同一个试管中进行。同一个试管中进行。两步法两步法 RT-PCR RT 反应与反应与 PCR 反应在反应在不同的试管中进行。不同的试管中进行。下游引物下游引物 特异性引物特异性引物 Oligo(dT)降落PCR（Touchdown PCRTouchdown PCR）用来避免非特异性序列的扩增用来避免非特异性序列的扩增

10、PCR中引物的黏合温度中引物的黏合温度(annealingtemperature)决定了决定了黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性产物。因此进行产物。因此进行PCR时需要时需要寻找合适的黏合温度寻找合适的黏合温度。降落降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个开始先设定一个比较高的黏合温度，每个循环黏合温度下降循环黏合温度下降1，到一个较低温度以后每个循环，到一个较低温度以后每个循环的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结的黏合温度保持不

11、变直到结束。在刚下降到特异性结合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏合温度的工作。合温度的工作。反向PCR(Inverse PCR,IPCR)扩增引物相反方向扩增引物相反方向DNADNA序列的技术序列的技术。用反向的互补引物。用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的

12、片段，而常规来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCRPCR扩增扩增的是已知序列的两引物之间的是已知序列的两引物之间DNADNA片段片段.实验时选择已知实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNADNA进行酶切，进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行用一对反向的引物进行PCRPCR，其扩增产物将含有两引物，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究外未知序列，从而对未知序进行分析研究.利用反向利用反向PCRPCR可可对未知序列扩增后进行分析对未

13、知序列扩增后进行分析，探索邻接，探索邻接已知已知DNADNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNAcDNA进行分子克隆，建立全长的进行分子克隆，建立全长的DNADNA探针。探针。1.1.用一种在靶序列上没有用一种在靶序列上没有切点的限制性内切酶切点的限制性内切酶 消化消化大分子量的大分子量的DNADNA2.2.产生的大小不同的线性产生的大小不同的线性DNADNA片段群体，其中具靶片段群体，其中具靶DNADNA区段的区段的DNADNA分子长度不超过分子长度不超过2-3Kb,2-3Kb,经连接后环化成环状经连接后环化成环状分子分子3.3.按靶序列设计的一对

14、向按靶序列设计的一对向外引物同靶序列外引物同靶序列5 5，-端互补端互补序列退火结合，其延伸方向序列退火结合，其延伸方向如图中箭头所指如图中箭头所指4.4.经经PCRPCR扩增产生的主要是扩增产生的主要是线性双链线性双链DNADNA分子，它是由分子，它是由左侧的序列和右侧序列首位左侧的序列和右侧序列首位连接而成，其接点就是限制连接而成，其接点就是限制酶的识别位点酶的识别位点不对称不对称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR ）：）：用于用于制备单链制备单链DNADNAlPCRPCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只及高浓度的

15、及高浓度的1%1%（或（或2%2%）。）。经过经过PCRPCR循环直到限循环直到限制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNADNA序序列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引物，则利用限制引物合成的物，则利用限制引物合成的DNADNA链做模板，继链做模板，继续引导续引导DNADNA合成。合成。l这样模板链继续再循环，由高浓度的引这样模板链继续再循环，由高浓度的引物合成的物合成的DNADNA要比限制引物多得多，而且要比限制引物多得多，而且仍保持单链状态。仍保持单链状态。多重多重PCRl一般一般PCR仅应用一对引物，通过仅应用

16、一对引物，通过PCR扩增产生扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定定.多重多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物，又称多重引物PCR或复合或复合PCR，它是在同一，它是在同一PCR反应体系里反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般程与一般PCR相同。相同。l多重多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因测或鉴定和病原微生物，

17、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。的分型鉴定。梯度PCR（Gradient PCR）是指我们在摸PCR条件的时候采取的一种手段，因为不能确认引物的最佳退火温度，会采用梯度PCR，同时在不改变其他PCR条件的情况下，对目的基因使用不同的退火温度，最终找到一个适合目的基因的退火温度。在这里，每个PCR反应管只有一个退火温度。实时实时荧光荧光定量定量PCRPCR技术技术 实现了实现了PCRPCR从从定性定性到到定量定量的飞跃的飞跃实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理指在指在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利，利用用荧光信号积累荧光信号积累实时监测整个实时监测整个PCRP

18、CR进程，进程，最后通过标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定对未知模板进行定量量分析的方法。分析的方法。特异性更强、特异性更强、有效解决有效解决PCRPCR污染、污染、自动化程度高、自动化程度高、实时监测实时监测反应过程反应过程Ct Ct 值的定义值的定义在荧光定量在荧光定量PCRPCR技术中重要概念技术中重要概念 CtCt值值C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值：值：每个反应每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系每个模板每个模板CtC

19、t值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，CtCt值越小值越小。利用已知起始拷贝数标准。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，品作标准曲线，横坐标横坐标起始拷贝数的对数，起始拷贝数的对数，纵坐标纵坐标代代CtCt值。只要获得未知样品的值。只要获得未知样品的CtCt值，即可从标准曲线上计算值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。出该样品起始拷贝数。巢式巢式PCRPCR（Nested PCR）l 巢式巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用，使用两对（而非一对）两对（而非一对）PCR引引物扩

20、增完整的片段物扩增完整的片段。第一对。第一对PCR引物扩引物扩增片段和普通增片段和普通PCR相似。第二对引物称相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩扩增片段的内部）结合在第一次增片段的内部）结合在第一次PCR产物产物内部，使得第二次内部，使得第二次PCR扩增片断短于第扩增片断短于第一次扩增。巢式一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常的扩增非常特异特异。l巢式巢式PCR，可以在，可以在106基因组背景下检测基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很到一个拷贝的病毒基因，所以特异性很好，但也是最容易污染的好，但也是最容易污染的PCR。谢谢