《基因工程载体B》PPT课件.ppt

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1、第第2 2节节 病毒病毒(噬菌体噬菌体)克隆载体克隆载体本节主要内容本节主要内容噬菌体病毒载体噬菌体病毒载体CosmidCosmid载体载体M13M13单链噬菌体病毒载体单链噬菌体病毒载体噬菌粒载体噬菌粒载体植物病毒载体植物病毒载体 CaMVCaMV(花椰菜花叶病病毒花椰菜花叶病病毒)克隆载体克隆载体 TMVTMV(烟草花叶病毒烟草花叶病毒)克隆载体克隆载体动物病毒载体动物病毒载体 SV40SV40克隆载体克隆载体 反转录病毒克隆载体（劳斯肉瘤病毒）反转录病毒克隆载体（劳斯肉瘤病毒）腺病毒克隆载体腺病毒克隆载体 痘苗病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体 杆状病毒表达克隆载体杆状病毒表达克隆载体噬菌体：

2、感染细菌的病毒噬菌体：感染细菌的病毒病毒病毒：一类超显微的非细胞生物：一类超显微的非细胞生物,每一种病毒只含有一种核酸每一种病毒只含有一种核酸 （DNADNA和和RNARNA不会并存于同一病毒颗粒中不会并存于同一病毒颗粒中）特点：特点：只能在活细胞内营专性寄生只能在活细胞内营专性寄生;离体条件下离体条件下,以无生命的化学大分子状态存在以无生命的化学大分子状态存在对抗生素不敏感，对干扰素敏感对抗生素不敏感，对干扰素敏感病毒与宿主关系来分：病毒与宿主关系来分：温和性病毒温和性病毒构建载体的好材料烈性病毒烈性病毒通过改造，也可用于构建载体病毒克隆载体应用的病毒克隆载体应用的局限性局限性：温和性病毒和

3、烈性病毒都温和性病毒和烈性病毒都存在严格的宿主专一性存在严格的宿主专一性部分病毒的性质部分病毒的性质一一.噬菌体噬菌体T2T2噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图三类典型形态的三类典型形态的病毒病毒：廿面体对称廿面体对称的结构的结构(球状球状)螺旋对称螺旋对称的结构的结构(杆状杆状)复合对称复合对称的结构的结构(蝌蚪状蝌蚪状)大肠杆菌的大肠杆菌的T4T4噬菌体噬菌体:由椭圆形由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成部组合而成 病毒中复合对称的代表病毒中复合对称的代表噬菌体的生命周期分为噬菌体的生命周期分为:溶菌周期溶菌周期和和溶源周期溶源周期烈性噬菌体烈性噬菌体:

4、只具有溶菌生长周期只具有溶菌生长周期的噬菌体的噬菌体温和噬菌体温和噬菌体:既能进入既能进入溶源生命周期溶源生命周期 又能进入又能进入溶菌周期溶菌周期的噬菌体的噬菌体溶源周期溶源周期:感染过程中无子代噬菌体颗粒感染过程中无子代噬菌体颗粒,噬菌体噬菌体DNADNA整合到寄主细胞染色体整合到寄主细胞染色体DNA,DNA,细菌继续生长增殖细菌继续生长增殖,噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制烈性噬菌体的繁殖途径PhagereproductivecyclePhagereproductivecycle吸附吸附Phageattachestobacterialc

5、ell.注入核酸注入核酸PhageinjectsDNA.合成核酸和蛋白质合成核酸和蛋白质PhageDNAdirectshostcelltomakemorephageDNAandproteinparts.装配装配Newphagesassemble.释放释放Celllysesandreleasesnewphages.透明的不长菌的小圆斑透明的不长菌的小圆斑典型的烈性噬菌体的生命周期典型的烈性噬菌体的生命周期 20-60min20-60min温和噬菌体的繁殖途径溶原化途径溶原化途径溶菌途径溶菌途径溶源性细菌特点：溶源性细菌特点：超感染免疫性超感染免疫性（抗御同种噬菌体再次感染的特性抗御同种噬菌体再次

6、感染的特性）溶源性细菌可诱发进入溶菌周期溶源性细菌可诱发进入溶菌周期(O OL L、O OR R摆脱摆脱cIcI阻阻遏蛋白后进入该周期遏蛋白后进入该周期)cI=阻遏基因阻遏基因O=操操纵基因基因P=启启动子子L=左向左向R=右向右向c、噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含噬菌体在宿主体外与蛋白质结合包装成为含双双链线状链线状DNA的颗粒，分为四个区的颗粒，分为四个区。噬菌体与噬菌体载体的特点：a、噬菌体是使用最早、研究最为详尽的大肠杆菌双噬菌体是使用最早、研究最为详尽的大肠杆菌双链链DNA噬菌体；噬菌体；1974年作为克隆载体使用。年作为克隆载体使用。中等大小的中等大小的温和噬菌体温和噬菌体

7、；常用于构建基因组文库和常用于构建基因组文库和cDNA文库文库；b、噬菌体载体噬菌体载体克隆效率远高于质粒载体克隆效率远高于质粒载体，获得的文，获得的文库大而完整，构建的文库容易筛选、扩增和保存库大而完整，构建的文库容易筛选、扩增和保存。线状线状噬菌体基因组的四个区：噬菌体基因组的四个区：左侧区、中间区、右侧区左侧区、中间区、右侧区（调控（调控成分、复制基因成分、复制基因O和和P、溶菌基因、溶菌基因S和和R）和）和末端结构末端结构（噬菌体的噬菌体的DNADNA在噬菌体中是线状在噬菌体中是线状DNADNA分子，基因组是一长约分子，基因组是一长约 48502bp 48502bp 的双链的双链DNA

8、DNA）噬菌体噬菌体coscos位点位点由由位于位于噬菌体线形双链噬菌体线形双链DNADNA的两端且完全互补的的两端且完全互补的粘末端粘末端（12bp12bp）结合成的双链）结合成的双链 称为称为CosCos位点位点att位点位点attLattR噬菌体插入大肠杆菌基因组方式噬菌体插入大肠杆菌基因组方式ChampbellChampbell模型模型噬菌体噬菌体DNA环化的化的噬菌体噬菌体DNAIntegrase催化链的交换催化链的交换包装限制：包装限制：离体条件下，将重组体离体条件下，将重组体DNADNA包入噬菌体等病毒颗粒包入噬菌体等病毒颗粒中以形成有功能的病毒载体；中以形成有功能的病毒载体；噬

9、菌体噬菌体头部外壳蛋白质容纳头部外壳蛋白质容纳DNADNA的能力的能力:上限：野生型上限：野生型DNADNA总量（总量（48kb48kb）的的5 5左右左右低限：野生型低限：野生型DNADNA总量（总量（48kb48kb）的的7575构建构建噬菌体的基本策略与技术路线：噬菌体的基本策略与技术路线：(1)(1)去除去除噬菌体非必须区噬菌体非必须区方法：方法：去除非必须片断去除非必须片断(复制、裂解等非必须复制、裂解等非必须)同时，抹去一些同时，抹去一些酶切位点酶切位点噬菌体的包装限制噬菌体的包装限制:大小大小51-36kb51-36kb之间之间溶菌途径：溶菌途径：噬菌体感染Ecoli后，线形 D

10、NA注入细胞内，若进入溶菌生长途径，则粘性末端连接成环状粘性末端连接成环状DNADNA分子分子，指令宿主细胞合成与包装相关的系列壳蛋白和酶，复制出新的DNA，包装成子代噬菌体颗粒，并在R蛋白和S蛋白的作用下，宿主细胞破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。依靠依靠coscos位点形成环状位点形成环状的的噬菌体噬菌体DNADNA代表性代表性噬菌体载体噬菌体载体插入型载体插入型载体(insertion vectors)(insertion vectors)：只具有一个可供：只具有一个可供外源外源DNADNA插入的克隆位点插入的克隆位点（只能承受（只能承受10kb10kb以内的小片段外源以内的

11、小片段外源DNADNA的插入，广泛用于的插入，广泛用于cDNAcDNA及及小片段小片段DNADNA的克隆）的克隆）置换型载体置换型载体(replacement vectors)(replacement vectors)：具有成对的克：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的隆位点，在这两个位点之间的 DNADNA区段可以被外源区段可以被外源插入的插入的 DNADNA片段所取代片段所取代（可承受较大分子量的外源可承受较大分子量的外源DNADNA片段的插入，适用于克隆高等真片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体核生物的染色体DNADNA）置换型置换型置换型置换型插入型插入型插入型插入型插入失活效

12、应：插入失活效应：外源的外源的DNADNA克隆进入克隆进入 插入型的插入型的载体分子上，会使噬菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。的某种生物功能丧失效力。免疫功能失活的免疫功能失活的（inactivatiort of immunityfunction）和和大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖苷半乳糖苷酶失活酶失活的的（inactlvatlon of Ecoli-galactosidase）置换型置换型一类在一类在噬菌噬菌体基础上改建体基础上改建的，在其中央的，在其中央部分有一个可部分有一个可以被外源插入以被外源插入的的DNADNA分子所取分子所取代的代的DNADNA片段的片段的克隆载体克隆载

13、体插入型载体插入型载体 置换型载体置换型载体插入型载体的克隆能力插入型载体的克隆能力置换型（取代）载体的克隆能力置换型（取代）载体的克隆能力(2)(2)标记基因标记基因噬菌斑：透明（有外源噬菌斑：透明（有外源DNADNA插入）和混浊插入）和混浊 -互补现象：蓝白斑、红白斑互补现象：蓝白斑、红白斑 Spi-Spi-：外源：外源DNADNA取代取代redred、gamgam基因，基因，能在能在P2P2噬菌体溶源性细菌中生长噬菌体溶源性细菌中生长(3)(3)建立外包装系统建立外包装系统转染转染(transfection)：裸露裸露DNADNA；由寄主细胞捕获裸露由寄主细胞捕获裸露的噬菌体的噬菌体DN

14、ADNA的过程。的过程。原核生物的转染就方法来说与转化是一样原核生物的转染就方法来说与转化是一样的的；将表达载体等导入真核细胞的过程将表达载体等导入真核细胞的过程转导转导(transduction)：包装后，噬菌体颗粒介导包装后，噬菌体颗粒介导宿主细胞中宿主细胞中噬菌体的包装过程噬菌体的包装过程头部头部:E蛋白占蛋白占72%：头部主要组成成分：头部主要组成成分琥珀突变琥珀突变使使噬菌体不能形成头部结构，噬菌体不能形成头部结构，导致尾部蛋白累积导致尾部蛋白累积D蛋白占蛋白占20%:DNADNA进入头部前体进入头部前体 以及头部成熟作用以及头部成熟作用琥珀突变琥珀突变使得使得噬菌体噬菌体DNA不能

15、进入头部，头部蛋白累积不能进入头部，头部蛋白累积噬菌体头部和噬菌体头部和尾部的体外装配尾部的体外装配是分开进行的是分开进行的D基因基因缺失突变株缺失突变株(D-):溶原菌菌株BHB2690E基因基因缺失突变株缺失突变株(E-)溶原菌菌株BHB2688注意：注意：噬菌载体噬菌载体+外源外源DNADNA的大小：的大小：36kb36kb52kb52kb体外包装：体外包装：噬菌载体噬菌载体 +尾部蛋白尾部蛋白 +头部蛋白头部蛋白 用于用于用于用于cDNAcDNAcDNAcDNA文库构建文库构建文库构建文库构建 外源目的基因的克隆外源目的基因的克隆外源目的基因的克隆外源目的基因的克隆噬菌体克隆载体的噬菌

16、体克隆载体的应用应用二二.粘粒粘粒(cosmidcosmid)噬菌体克隆外源DNA能力，最大23kbp，较为有效的克隆为15kbp在研究基因组功能时，需要更大克隆能力的载体(鸡胶原蛋白基因长鸡胶原蛋白基因长38kb38kb)，设计构建了cosmid(黏粒或柯斯质粒)粘粒定义粘粒定义:包含包含噬菌体噬菌体coscos位点的质粒，因此，质位点的质粒，因此，质 粒粒DNADNA在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹在体内可以被噬菌体衣壳蛋白包裹 包含包含coscos两端两端280bp280bp以上的序列以上的序列以及以及包装相关序包装相关序列。列。剩余部分为质粒，具有质粒的性质；剩余部分为质粒，具有质粒的性

17、质；大小约大小约4 46kb6kb 进行有效包装，插入片断后，总大小要在进行有效包装，插入片断后，总大小要在36.4-51bp36.4-51bp之间之间(允许克隆的外源允许克隆的外源DNADNA片段长度为片段长度为 313145kb)45kb)粘粒的特点粘粒的特点:(1)(1)具有具有部分部分噬菌体噬菌体特点特点 体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞，体外包装后，高效转导敏感型大肠细胞，进入后环化进入后环化(2)(2)具有具有质粒特点质粒特点 复制、抗性复制、抗性(3)(3)高容量克隆能力高容量克隆能力 极限可达极限可达45kbp45kbp噬菌体噬菌体包装必备条件包装必备条件:coscos位点位

18、点末端酶末端酶(teminaseteminase)CosmidCosmid克隆载体克隆载体cosmidcosmid（coscos site-site-carringcarring plasmid plasmid）：）：人工构建的含有人工构建的含有DNADNA的的coscos位点位点序列和序列和质粒复质粒复制子制子的特殊类型的质粒载体的特殊类型的质粒载体pHC79柯斯质粒载体柯斯质粒载体pHC79pHC79的形体图的形体图由由pBR322pBR322质粒质粒DNADNA与与噬菌体噬菌体DNADNA的的coscos位点及其控制包装位点及其控制包装作用的序列构成作用的序列构成部分柯斯质粒的基本特性部

19、分柯斯质粒的基本特性柯斯质粒载体的特点：柯斯质粒载体的特点：1 1）具有）具有噬菌体的特性噬菌体的特性（但因不含全部必需基因，（但因不含全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）粒）2 2）具有质粒的特性）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）（有质粒复制子及抗菌素基因）3 3）具有高容量的克隆能力）具有高容量的克隆能力（本身仅（本身仅5-7kb,5-7kb,克隆极克隆极限可达限可达45kb45kb左右）左右）4 4）具有与同源序列质粒进行重组的能力）具有与同源序列质粒进行重组的能力广泛应用于基因组广泛应用于基因组DNADNA文库

20、的构建文库的构建柯斯克隆柯斯克隆（cosmidcosmid cloning cloning）理论依据：理论依据：1 1）在线性噬菌体在线性噬菌体DNADNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列出序列（coscos位点位点)2 2）在在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNADNA拷贝组拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，成的多连体分子。在此种分子中，前后两个前后两个DNADNA基因组之间都是基因组之间都是通过通过coscos位点连接起来的位点连接起来的3 3）噬菌体具有的一种位点特异的切割体系噬菌体

21、具有的一种位点特异的切割体系(site-specific(site-specific cutting system),cutting system),又叫又叫TerTer体系，体系，能识别两个相距适宜的能识别两个相距适宜的coscos位点位点(38-45kb)(38-45kb)，将多连体分子切割成将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包单位长度的片段，并将它们包装到装到噬菌体头部中去噬菌体头部中去(如如EcoREcoR I)I)38kb-52kb38kb-52kbM13M13噬菌体噬菌体M13M13单链单链DNADNA噬菌体的噬菌体的 生命周期生命周期M13M13噬菌体是一丝状噬菌体是一丝

22、状噬菌体，内有一个环噬菌体，内有一个环状单链状单链DNADNA分子分子（“+”+”链链DNADNA）,长长6407bp6407bpM13M13噬菌体的特点噬菌体的特点 感染Ecoli后，在宿主细胞内形成双链的复制型DNA（replicationformDNA,RFDNA），可以象质粒DNA那样在体外进行纯化和操作。成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞（噬菌体的感染位点在性散毛上）。但RF DNA或ss DNA都能转染E.coli的F+或F-细胞。噬菌体颗粒的大小是受其DNA的大小制约的（正好与噬菌体相反），因此它不存在包装限制问题。M13M13噬菌体噬菌体6.4kb单链环状正链单链环

23、状正链DNADNA基因组基因组作载体的优点：作载体的优点：1)1)RF DNA RF DNA 和和SS DNASS DNA都可转染都可转染E.coliE.coli，产生噬菌斑；，产生噬菌斑；2)2)无包装限制问题（可无包装限制问题（可6 6倍于倍于M13M13基因组）；基因组）；3)3)复制以双链环形复制以双链环形DNADNA为中间媒介；为中间媒介；4 4）易测出外源易测出外源DNADNA的插入方向；的插入方向；5 5）可产生能直接测序的单链可产生能直接测序的单链DNADNA分子。分子。构建构建M13噬菌体克隆载体的策略和途径噬菌体克隆载体的策略和途径详见第二版P116噬菌粒载体（噬菌粒载体（

24、phagemid vector)由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的载体系统，由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的载体系统，称为噬菌粒（称为噬菌粒（phagemidphagemid或或phasmidphasmid）噬菌体噬菌体质粒质粒单链噬单链噬菌体菌体辅助噬菌体辅助噬菌体 大肠杆菌大肠杆菌寄主菌株寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13变异株变异株 XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的一般特征几种常用的噬菌粒载体的一般特征pUC

25、119pUC119(MCS)(MCS)pUC118(MCS)puC118puC118和和pUC119pUC119噬菌粒载噬菌粒载体的分子体的分子结构结构噬菌粒载体的特点噬菌粒载体的特点（1 1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNADNA，可克隆高达可克隆高达10 kb10 kb的外源的外源DNADNA；拷贝数高；拷贝数高；（2 2）有）有ampampr r 等基因作为选择记号；可用组织化学显色反应等基因作为选择记号；可用组织化学显色反应 筛选重组子；存在多克隆位点；筛选重组子；存在多克隆位点；（3 3）具质粒复制起点，）具质粒复制起点，在无辅

26、助噬菌体存在下在无辅助噬菌体存在下，克隆外源，克隆外源 基因可按质粒一样复制；基因可按质粒一样复制；（4 4）有单链噬菌体复制起点，）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主在有噬菌体辅助感染的宿主 细胞中细胞中，可合成出单链，可合成出单链DNADNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒拷贝，并包装成噬菌体颗粒 分泌到培养基中。分泌到培养基中。（5 5）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序）可直接对克隆的基因进行核苷酸测序CaMVCaMV(花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒)载体系统：双链载体系统：双链DNADNA病毒病毒TMV(烟草花叶病毒)载体系统：单链单链RNARNA病毒病毒其他植物病毒载体系统，如单链

27、单链DNADNA病毒病毒：番茄金黄花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、玉米线条病毒、小麦矮缩病毒，以及RNARNA病毒病毒：雀麦草花叶病毒、大麦条纹花叶病毒、番茄丛矮病毒等等。植物病毒载体植物病毒载体花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒(caulimoviruscaulimovirus，CaMVCaMV)：实际上是一个：实际上是一个病毒群，已知有病毒群，已知有1212个种。该病毒是为数不多的植物双链个种。该病毒是为数不多的植物双链DNADNA病毒之一。病毒之一。每个种的寄主范围都很窄，每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株不感染豆类和单子叶植株，它的它的寄主主要是十字花科植物（集中在芸苔属）和少数非寄

28、主主要是十字花科植物（集中在芸苔属）和少数非十字花科（如茄科）植物十字花科（如茄科）植物。CaMVCaMV DNA DNA的特征：的特征：在病毒颗粒中，在病毒颗粒中，CaMVCaMV DNA DNA分子以开环形式存在，两条链分子以开环形式存在，两条链的一定位置出现核苷酸序列不连续的缺口（负链：的一定位置出现核苷酸序列不连续的缺口（负链：1 1个，个，即即G1G1；正链：；正链：2 2个，即个，即G2G2和和G3G3）。）。CaMVCaMV(花椰菜花叶病毒花椰菜花叶病毒)载体系统载体系统构建构建CaMVCaMV载体的基本策略载体的基本策略自然条件下，自然条件下，CaMVCaMV感染宿主后，其感染

29、宿主后，其DNADNA可以侵入植物细胞，可以侵入植物细胞，但不插入染色体但不插入染色体DNADNA，而是在细胞内复制、转录和翻译，而是在细胞内复制、转录和翻译，但其结果是导致植物的病害。根据此特征，构建载体的基但其结果是导致植物的病害。根据此特征，构建载体的基本策略是：本策略是：合理利用合理利用CaMVCaMV DNA DNA能侵入植物细胞的特性能侵入植物细胞的特性，可以将，可以将外源基因导入植物体内，但需要外源基因导入植物体内，但需要消除消除CaMVCaMV对植物的致对植物的致病性病性。详见详见 第二版第二版 P130P130质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足动质粒和噬菌体载体只能在

30、细菌中繁殖，不能满足动物物DNADNA重组的需要。重组的需要。能感染动物的病毒可改造为动物能感染动物的病毒可改造为动物细胞的载体细胞的载体病毒载体多为穿梭载体：动物细胞的培养和操作较复杂、花费病毒载体多为穿梭载体：动物细胞的培养和操作较复杂、花费较多较多动物病毒载体动物病毒载体常用病毒载体常用病毒载体:改造来自猴肾病毒改造来自猴肾病毒SV40SV40（Simian Simian Virus 40Virus 40）、逆转录病毒、腺病毒逆转录病毒、腺病毒和和昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒等等目的目的:将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等其

31、功能、或作基因治疗等SV40病毒病毒SV40SV40病病毒毒呈呈小小型型2020面面体体，环环状状DNADNA，外外壳壳蛋蛋白白由由VP1VP1、VP2VP2、VP3VP3构成。构成。基因结构基因结构早早期期表表达达区区编编码码大大T T抗抗原原和和小小t t抗抗原原（即即肿肿瘤瘤蛋蛋白白质质或或抗抗原原）。T T抗抗原原的的功功能能是是控控制制SV40SV40基基因因组组的的复复制制和和调调节节。小小t t抗原的功能不详抗原的功能不详晚期表达区合成晚期表达区合成Vp1Vp1、Vp2Vp2、Vp3Vp3（外壳蛋白外壳蛋白），），包装释放包装释放受受纳纳细细胞胞（permissive permi

32、ssive cellcell）：病病毒毒感感染染宿宿主主细细胞胞后，使细胞裂解，并释放感染性病毒颗粒。后，使细胞裂解，并释放感染性病毒颗粒。非非受受纳纳细细胞胞（non non permissive permissive cellcell）：不不产产生生感感染性病毒颗粒，而病毒染性病毒颗粒，而病毒DNADNA整合到细胞染色体中产生癌变。整合到细胞染色体中产生癌变。半半受受纳纳细细胞胞（semi-permissive semi-permissive cellcell）:只只有有部部分分被感染的细胞会裂解产生出感染性的病毒颗粒被感染的细胞会裂解产生出感染性的病毒颗粒。(1)(1)取代型取代型基因载

33、体基因载体取代型基因载体取代型基因载体 特点：外源特点：外源DNADNA直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的直接插入在缺陷型的病毒基因组上。插入的外源外源DNADNA片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，片段在大小同被取代的病毒基因组区段是等同的，这样形成的重组体这样形成的重组体DNADNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。并被包装成病毒颗粒。但为了补充被取代的病毒基因组但为了补充被取代的病毒基因组DNADNA的功能，必须的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。使用一种与之互补的辅助病毒。含有完整早期含有完整早期区段和复制起区段和复制起

34、点的病毒点的病毒-质质粒载体粒载体晚期区段取代载体晚期区段取代载体SV40SV40晚期基因被外源晚期基因被外源DNADNA取代后，失去合成外壳蛋取代后，失去合成外壳蛋白功能，白功能，若加入一种若加入一种温度敏感（温度敏感（tsts）的辅助病毒的辅助病毒tsA58tsA58（它它是一种在是一种在4141下便不能合成下便不能合成T T抗原的突变体），抗原的突变体），与缺乏了与缺乏了整个晚期区段功能的整个晚期区段功能的SV40SV40病毒，可以互补，这两病毒，可以互补，这两种病毒混合感染时，仍然能够增殖。种病毒混合感染时，仍然能够增殖。重组体病毒能提供此种重组体病毒能提供此种T T抗原，抗原，tsA

35、58tsA58则可以复制，则可以复制，并合成出外壳蛋白质，这样就能在受纳细胞中扩并合成出外壳蛋白质，这样就能在受纳细胞中扩增表达增表达。早期区段取代载体早期区段取代载体这种载体被外源基这种载体被外源基因取代早期基因而因取代早期基因而缺失大缺失大T T抗原，可抗原，可由由COSCOS细胞提供大细胞提供大T T抗原，故可利于重抗原，故可利于重组病毒在组病毒在COSCOS细胞细胞中增殖和扩增。中增殖和扩增。(2)(2)病毒病毒-质粒重组型质粒重组型 基因载体基因载体一类穿梭载体一类穿梭载体 例如：由大例如：由大T T抗原、复制子和抗原、复制子和pBR322pBR322构成构成pAC10pAC10载载

36、体。在体。在细菌中扩增细菌中扩增提取基因重组质粒，转染提取基因重组质粒，转染小鼠小鼠细胞细胞5-65-6天后可高拷贝扩增并天后可高拷贝扩增并高效表达基因产物高效表达基因产物。微型病毒复制子微型病毒复制子-质粒载体，可用特殊细胞来克隆质粒载体，可用特殊细胞来克隆和表达和表达相当于相当于 植物的一元载体；植物的一元载体；其他动物病毒载体系统其他动物病毒载体系统-自学自学逆转录病毒基因载体逆转录病毒基因载体腺病毒基因载体腺病毒基因载体痘苗病毒基因载体痘苗病毒基因载体杆状病毒表达载体杆状病毒表达载体详见P135第第3 3节节染色体定位整合载体染色体定位整合载体基因工程龙敏南 第二版 P120 楼士林

37、第一版 P138质粒与病毒克隆载体的不足：质粒与病毒克隆载体的不足：1 1、游离于染色体之外的外源、游离于染色体之外的外源DNADNA分子能多拷贝复制，分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳定性但易丢失，导致转基因生物的不稳定性2 2、随机插入染色体的外源、随机插入染色体的外源DNADNA片段能稳定维持，但片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组的自稳系统，导致有害突变，造成选育转基因生的自稳系统，导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度物不可知性，增加难度设计背景（染色体定位整合载体）设计背景（染色体定位整合载

38、体）染色体定位整合平台系统(gene integration platform system)整合平台整合平台：外源DNA整合位置,即受体细胞基因组上给定的DNA区域定位整合载体定位整合载体:除含有一般质粒必备元件外，具有一个或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段（长度最好1kb）基因打靶基因打靶 (gene targeting)基因定点同源重组基因定点同源重组 (site-specifichomologus recombination)定位整合克隆载体的几种模式定位整合克隆载体的几种模式:(1)(1)内源平台内源平台双交换双交换置换置换克隆载体克隆载体(2)(2)外源平台外源平台双交换双

39、交换置换置换克隆载体克隆载体(3)(3)内源平台内源平台双交换双交换插入插入克隆载体克隆载体(4)(4)内源平台内源平台单交换单交换插入插入克隆载体克隆载体一、定位整合克隆载体的几种模式一、定位整合克隆载体的几种模式（一）内源平台双交换置换克隆载体（一）内源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（二）外源平台双交换置换克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（三）内源平台双交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体（四）内源平台单交换插入克隆载体定位整合效率定位整合效率与受体细胞的种属和同源与受体细胞的种属和同源DNADNA片段的长短有关片段的长短有关整合效率偏低，有待改

40、进整合效率偏低，有待改进第第4 4节节人工染色体克隆载体人工染色体克隆载体artificialchromosome基因工程龙敏南 第二版 P142 楼士林 第一版 P146大片段克隆载体大片段克隆载体显著特点：载体的容载能力扩大显著特点：载体的容载能力扩大,约约100100350kb,350kb,主要有主要有:酵母酵母人工染色（人工染色（YAC)YAC)细菌细菌人工染色体（人工染色体（BAC)BAC)源于噬菌体源于噬菌体P1P1的染色体（的染色体（PAC)PAC)哺乳动物哺乳动物人工染色体（人工染色体（MACMAC）人类游离人类游离人工染色体（人工染色体（HAECHAEC）酵母人工染色体酵母人

41、工染色体(YAC)YAC载体的复制元件是其核心组成成分:大肠杆菌中复制起始位点复制起始位点(ori)其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒着丝粒（centromere,CEN）两个端粒端粒（TEL）筛选主要是营养缺陷型筛选主要是营养缺陷型YACYAC载体的突出特点载体的突出特点:容载能力大容载能力大动物的YAC文库平均插入长度达9002000kb植物YAC文库平均插入片段一般为100350kb 构建基因组文库时构建基因组文库时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整只需要较少的克

42、隆数便可以覆盖整个基因组个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱成为可能成为可能,基因组计划得以顺利实施。基因组计划得以顺利实施。缺点缺点:1)1)克隆外源基因克隆外源基因存在嵌合现象存在嵌合现象(chimerismchimerism)2)2)有些有些YACYAC克隆的稳定性差克隆的稳定性差 3)3)插入片段的分离和纯化困难，插入片段的分离和纯化困难，YACYAC克隆不克隆不容易与酵母自身染色体相分离容易与酵母自身染色体相分离4)4)转化效率低转化效率低酵母人工染色体的应用领域酵母人工染色体的应用领域 在染色体区带构建在染色体区带构建YACYAC重

43、叠群，可以促进重叠群，可以促进大规模基因组测序和致病基因的克隆。大规模基因组测序和致病基因的克隆。细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)在大肠杆菌在大肠杆菌FF因子因子的基础上发展而来的的基础上发展而来的,其复制是其复制是严谨型严谨型的的,在每个细胞中仅有在每个细胞中仅有1 122个拷贝个拷贝,减小了插减小了插入片段发生重组的机率入片段发生重组的机率人工构建的人工构建的BACBAC较小（较小（如如pBeloBAC11pBeloBAC11仅有仅有7.4 kb7.4 kb，保留了与，保留了与F F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因）

44、克隆能力可达克隆能力可达300 kb300 kb以上，远大于柯斯质粒，但小于以上，远大于柯斯质粒，但小于YACYAC筛选通过抗性、蓝白斑等筛选通过抗性、蓝白斑等BAC载体的容载能力一般为100350kb(1)(1)转化率高转化率高(2)(2)提取质粒较方便提取质粒较方便 (3)(3)嵌合及重组现象少嵌合及重组现象少 (4)(4)筛选目的基因筛选目的基因,方便快捷方便快捷(5)T7(5)T7和和Sp6Sp6聚合酶启动子聚合酶启动子,可以用于转录可以用于转录获得获得RNARNA探针或直接用于插入片段的末端测探针或直接用于插入片段的末端测序序 六倍体小麦小偃54的BAC文库情况小偃小偃5454的的B

45、ACBAC文库刚建成时有文库刚建成时有937,920937,920个克隆，约覆盖基因组个克隆，约覆盖基因组5 5倍。倍。BACBAC文库共有三级：文库共有三级：一级库：一级库：488488块板块板每个板有每个板有384384个孔个孔每个孔里有每个孔里有5 5个克隆个克隆二级库：二级库：243243块板块板每个板是每个板是9696孔孔每个孔里有每个孔里有58=4058=40个克隆个克隆三级库：三级库：保存在保存在1,9541,954个个1.5ml1.5ml的离心管中，每个离心管中有的离心管中，每个离心管中有5812=4805812=480个克隆；个克隆；三级库同时配备有质粒三级库同时配备有质粒D

46、NADNA，以便于筛库。，以便于筛库。目前三级库可用的大约有目前三级库可用的大约有 2020个个9696孔板，即孔板，即2096=19202096=1920个克隆个克隆P1派生人工染色体（派生人工染色体（PAC）P1噬菌体载体是在P1噬菌体的基础上构建的克隆载体，用于克隆真核基因组DNA。P1派生人工染色体（PAC)是将BAC和P1噬菌体载体二者优点结合起来的克隆体系，可以克隆100-300kb的外源DNA片段。特点1）含有卡那霉素抗性基因，便于筛选。2）其在宿主细胞中以单拷贝的形式存在，避免了因多拷贝造成的不稳定。PACPAC载体载体哺乳动物人工染色体（哺乳动物人工染色体（MAC）从哺乳动物

47、细胞中分离出复制起始区、端粒以及从哺乳动物细胞中分离出复制起始区、端粒以及着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于着丝粒构建而成的克隆载体。它可以克隆大于1000kb1000kb的外源的外源DNADNA片段。片段。应用领域应用领域1 1）有丝分裂和减数分裂对）有丝分裂和减数分裂对DNADNA片段大小的定量分析。片段大小的定量分析。2 2）研究哺乳动物细胞中染色体功能。）研究哺乳动物细胞中染色体功能。3 3）对复杂的基因做功能分析。）对复杂的基因做功能分析。4 4）用于体细胞基因治疗。）用于体细胞基因治疗。人类游离人工染色体（人类游离人工染色体（HAEC）基于人类EB病毒而构建的环形DNA，含有

48、EB病毒的复制原点(oriP)和潮霉素抗性基因。能以环形小染色体形式复制，并在有丝分裂中保持稳定。HAEC可能会成为基因治疗的重要载体第第5 5节节特殊用途克隆载体特殊用途克隆载体2002年第一版年第一版P149书名:基因工程基因工程作者:楼士林楼士林杨昌盛杨昌盛龙敏南龙敏南章章军军出版社:科学出版社科学出版社ISBN:7-03-010183-9几种特殊用途载体:1)启动子探针克隆载体2)诱导表达克隆载体3)反义表达克隆载体4)组织特异性表达克隆载体5)分泌型表达克隆载体等质粒质粒*受体细胞受体细胞结构结构插入片断插入片断举例举例 E.coliE.coli环状环状 8*8*p pUCUC18/

49、19,T-18/19,T-载体载体pGEMpGEM-3z-3z等等 噬菌体噬菌体E.coliE.coli线状线状9-24kb9-24kbEMBLEMBL系列，系列，gtgt系列系列丝状噬菌体及噬菌粒丝状噬菌体及噬菌粒E.coliE.coli环状环状 10 kb 10 kbM13mpM13mp系列系列粘粒载体粘粒载体E.coliE.coli环状环状35-45kb35-45kbpJB8,c2RB,pJB8,c2RB,pcoslEMBLpcoslEMBL,pWE15/16,pWE15/16,pCVpCV BAC BAC(Bacterial(Bacterial Artificial Artificia

50、l ChroChromomosome)some)E.coliE.coli环状环状300 kb300 kbPelPel oBACoBAC系列系列PAC PAC(P1-derived(P1-derived Artificial chromosome)Artificial chromosome)E.coliE.coli环状环状100-2000 kb100-2000 kbPCYPAC1PCYPAC1YAC YAC(Yeast Artificial(Yeast Artificial chromosome)chromosome)酵母细胞酵母细胞线性染色体线性染色体100-2000 kb100-2000 k