《测序技术介绍》PPT课件.ppt
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1、测序技术介绍测序技术介绍测序技术发展史一代测序1954 年,Whitfeld 等用化学降解法测定多聚核糖核苷酸序列,是关于DNA 测序技术的较早报道。1977 年,Sanger 发明DNA 双脱氧核苷酸末端终止测序法(chain terminator sequencing),A.M.Maxam 和W.Gilbert 发明DNA 化学降解测序法(chemical degradation sequencing),2 项技术的出现,标志第1 代测序技术诞生。Sanger 测序法的原理每一次DNA 测序反应都由4 个独立反应组成;由于DNA 双链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键相连,因此在测序过程中掺入2
2、,3-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(不含3-OH),当ddNTP 位于DNA 双链的延伸末端时,无羟基3端不能与其他脱氧核苷酸形成3,5-磷酸二酯键,因此,DNA 双链合成便终止;若在终止位点掺入ddATP,则新生链末端为A,若掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP,相应地,新生链末端则是T、C 或G。该测序技术的具体做法如下:将模板、引物、4 种dNTP(其中含有一种为放射性同位素标记的核苷酸)与DNA 聚合酶共同保温,形成的混合物包含许多长短不一的片段,最后利用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS-PAGE)分离该混合物,得到放射性同位素自显影条带图谱,人们依据凝胶电泳图即可读出DNA 双链的碱基
3、序列组成。自动化测序实际上已成为当今 dna序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等dna测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。测序过程中的常见问题分析在进行DNA测序时,紧接引物的10 30 Bases有时不一定能完全读清楚。由于DNA结构上的原因,有时会出现反应中途无法进行之情况。如:G/C rich;G/C Cluster;Poly A、Poly T的连续结构等。此外,另一种情况为反应中途出现的套峰现象,此种情况一般为DNA结构中的重复序列,造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合位点。具体问题分析如下:1:测测
4、序序结结果果有有很很多多套套峰峰,出出现现很很多多N值值原因分析:PCR产物直接进行测序,在PCR产物长度以后将无反应信号,机器将产生许多N值。在序列的起始端出现N值,主要是由于有未去除的染料单体造成的干扰峰,是机器无法正确判读出位何值。有时,引物二聚体或者起始端小片段的丢失,也会出现N值。模版本身含杂合序列,有等位基因。测序过程中的常见问题分析2:为为什什么么找找不不到到我我的的PCR引引物物序序列列?用PCR引物作为测序引物,所测序列是从引物3末端后第一个碱基开始的,所以就找不到您的测序引物了。可以进行反向测序,得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中,由于通用引物与插入序
5、列有一段距离,就可以测出您的引物序列。3:测测序序结结果果和和文文献献资资料料不不一一样样,为为什什么么?原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序,那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致。4:过过短短的的PCR产产物物为为什什么么不不适适于于直直接接测测序序?首先由于一般的PCR产物纯化试剂盒要求产物片段大于200bp,过短的PCR产物不能进行纯化;再者,测序的前50bp和后50bp的序列是不好的,所以不适于直接测序。测序过程中的常见问题分析5:酒酒精精如
6、如果果没没有有挥挥发发完完全全,在在约约300bp处处会会出出现现连连续续异异常常的的G峰峰,酒酒精精挥挥发发时时间过长会导致间过长会导致DNA断裂。断裂。第一个峰,重叠干扰。如果不判读为干扰峰,那就说明样品不纯,如果是基因组DNA,就很好地说明了样品为杂合子,该位点可能存在SNP现象(T/G)。如果判读为干扰峰,我们只需认定样品此处碱基为T为行了。第二个峰,错位干扰。如果不判读为干扰峰,则说明样本可能比预期多一个碱基(G),如果判读为干扰峰,我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。测序过程中的常见问题分析6:为什么用:为什么用PCR产物或质粒测序时,经常会出现套峰现象产物或质粒测序时,经常会出
7、现套峰现象?下图是pGEM-T载体测序的结果,在83位点处测序结果出现双峰,即模板中含有两个或两个以上的相同载体,但是插入片段不同。解决办法:重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是,重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段,并不足以证明模板的单一。测序过程中的常见问题分析7:poly结构的测序结果结构的测序结果以polyT为例,在polyA/T结构之后往往出现移码现象,而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减。解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该poly结构处,即可完成模板全长的拼接。第二代测序技术(Next-Generation Sequencing)各自
8、的优点454 测序平台得到的片段能够达到400 bp,并且读长的质量高;Solexa 测序平台的性价比最高,在数据量相同的情况下,测序成本仅为454 测序平台的1/10;SOLiD 测序平台准确度能够达到99.94%,在片段覆盖率为15时,测序准确度可接近100%。2005年底,454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System,这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后,罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司,并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统,该系统可在10小时的运行中获得100万条读长(reads),46亿个碱
9、基信息(base pair),且准确率达到99%以上。2008年,GS FLX系统再次升级,通量提高了5倍,读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪,但截至2011年3月,利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇,而它在读长上的优势明显胜于另两套系统,因此在从头测序(de novo)和宏基因组测序(meta genome)方面有着不可替代的地位。2006年,Solexa公司也推出了自己的NGS系统Genome Analyzer,简称GA。这套基于DNA簇(DNA cluster)、桥式PCR(Bridge PCR)和可逆阻断(Reversible t
10、erminator)等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年,Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa,使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据,因此也有1Gb Analyzer的含义,而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据,读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称,Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验,Tb(1000Gb)级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计,Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台,20
11、10年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000,一举成为全球最大的基因组测序与分析中心,Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。在Sanger测序时代,美国应用生物系统公司(ABI)一直是该行业的龙头老大,其垄断地位无人能撼,从早期的377到全自动化的3730 xl,ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初,ABI起步较晚,显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台,ABI的领先地位受到威胁,这才开始发力,迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt,并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOL
12、iD不断升级,目前已到SOLiD 5版本(SOLiD 5500 xl)。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection,即寡聚物连接检测测序,其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接,发出不同的荧光信号,从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下,目标序列的所有碱基都被读取了两遍,因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉,SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天,成本低于60美元/Gb,准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序,因此对于高GC含量的样本,SOLiD系统具
13、有非常大的优势。2023/2/6454测序原理焦磷酸测序法(Pyrosequencing)的原理2023/2/6454测序原理焦磷酸测序法(Pyrosequencing)的原理2023/2/6454测序原理焦磷酸测序法(Pyrosequencing)的原理2023/2/6454测序原理l在454测序仪中,A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的,每步反应四种碱基依次加入反应池,当碱基配对结合,就会释放出一个焦磷酸(PPi),而这个焦磷酸在酶的作用下,将荧光素氧化成氧化荧光素,并发出光信号,从而读取出这一位置的碱基信息。454测序仪的整个实验步骤可大致概括为:样品处理文库制备emPCR
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