《高三生物复习资料》实验1-大肠杆菌的培养和分离.ppt

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1、选修选修1 1 生物技术实践生物技术实践微生物的利用微生物的利用酶的应用酶的应用果酒的制作果酒的制作泡菜的腌制泡菜的腌制植物组织培养植物组织培养选修选修1 1 生物技术实践生物技术实践l实验实验1 大肠杆菌的培养与分离大肠杆菌的培养与分离l实验实验2 分离以尿素为氮源的微生物分离以尿素为氮源的微生物l实验实验4 果汁中的果胶与果胶酶果汁中的果胶与果胶酶l实验实验6-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测l实验实验8 果酒及果醋的制作果酒及果醋的制作l实验实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定l实验实验11 植物的组织培养植物的组织培养浙科版

2、浙科版人教版人教版第一部分第一部分 微生物的利用微生物的利用一、微生物的类群一、微生物的类群微生物是指结构简单、形体微小的微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细单细胞、多细胞或没有细胞结构胞或没有细胞结构的低等生物，包括的低等生物，包括病毒、原核病毒、原核生物、原生生物和某些真菌生物、原生生物和某些真菌。大约有10万种微生物，多数微生物对人类是有益的！任务任务1：请将中学阶段涉及的微生物进行分类。：请将中学阶段涉及的微生物进行分类。T2噬菌体、烟草花叶病毒、流感病毒、噬菌体、烟草花叶病毒、流感病毒、HIV病毒、病毒、劳氏肉瘤病毒劳氏肉瘤病毒大大肠肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、醋酸杆菌、杆菌、乳

3、酸菌、枯草杆菌、醋酸杆菌、肺炎双球菌、霍乱弧菌、幽肺炎双球菌、霍乱弧菌、幽门门螺旋菌螺旋菌、放、放线线菌、菌、支原体、支原体、蓝细蓝细菌、菌、酵母菌、青霉菌、黑曲霉、酵母菌、青霉菌、黑曲霉、食用菌食用菌草履虫、草履虫、变变形虫、形虫、伞伞藻、藻、绿绿藻、金藻、金鱼鱼藻、衣藻、藻、衣藻、结构结构细胞壁细胞壁细胞膜细胞膜细胞质细胞质拟拟 核核特殊的结构特殊的结构二、细菌二、细菌单细胞原核生物单细胞原核生物形态：形态：杆形、球形、弧形、螺旋形杆形、球形、弧形、螺旋形荚膜荚膜鞭毛鞭毛芽孢芽孢主要成分是主要成分是肽聚糖肽聚糖，可被某些，可被某些溶菌酶溶菌酶水解，水解，青霉素青霉素能抑制其合成。能抑制其合

4、成。唯一的细胞器：唯一的细胞器：核糖体核糖体。质粒：质粒：小型小型的的环状环状DNA分子，控制抗药性等性状。分子，控制抗药性等性状。由一个由一个大型大型的的环状环状DNA反复折叠缠绕而成反复折叠缠绕而成,控制着细菌的主要遗传性状。控制着细菌的主要遗传性状。细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆性很强的细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆性很强的休眠体、具厚壁休眠体、具厚壁，以度过不良的环境，以度过不良的环境。主要成分为多糖，与其致病性有关。主要成分为多糖，与其致病性有关。由蛋白质组成，与运动有关。由蛋白质组成，与运动有关。（主要以（主要以二分裂二分裂方式进行）方式进行）细菌的繁殖方式细菌的繁殖方式菌落可

5、以作为菌种鉴定的重要依据。菌落可以作为菌种鉴定的重要依据。菌落：菌落：单个或少数细菌在固单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖形成的体培养基上大量繁殖形成的肉眼可见、有一定形态结构肉眼可见、有一定形态结构的细胞群。的细胞群。单菌落：单菌落：单个细菌在固体培单个细菌在固体培养基上大量繁殖形成的独立养基上大量繁殖形成的独立的单个菌落。的单个菌落。细菌的鉴定细菌的鉴定菌落和单菌落菌落和单菌落异养需氧型异养需氧型异养厌氧型异养厌氧型自养需氧型自养需氧型自养厌氧型自养厌氧型大多数细菌的代谢类型属于什么方式大多数细菌的代谢类型属于什么方式?在生态系统中处于什么地位在生态系统中处于什么地位?分解者或消费者分解

6、者或消费者生产者生产者菌落在生态学上属于什么单位菌落在生态学上属于什么单位？大肠杆菌是大肠杆菌是革兰氏阴性革兰氏阴性、兼性厌氧兼性厌氧的肠道杆菌。的肠道杆菌。实验实验1 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离由于易培养、繁殖快，被广泛用于基因工程。如何扩大由于易培养、繁殖快，被广泛用于基因工程。如何扩大培养？如何从可能污染的菌群中分离大肠杆菌并保存？培养？如何从可能污染的菌群中分离大肠杆菌并保存？革兰氏染色：细菌经紫色的革兰氏染液染色后，再用酒精革兰氏染色：细菌经紫色的革兰氏染液染色后，再用酒精脱色，可把细菌分为两大类：仍被染成紫色的即为革兰氏脱色，可把细菌分为两大类：仍被染成紫色的即为革兰

7、氏阳性菌阳性菌(G+)(G+)和脱去染色的为革兰氏阴性菌和脱去染色的为革兰氏阴性菌(G-)(G-)。这两种细。这两种细菌的差别在于细胞壁的成分不同。菌的差别在于细胞壁的成分不同。知识要点知识要点培养基的分类和成分培养基的分类和成分无菌技术：消毒、灭菌无菌技术：消毒、灭菌两种分离纯化的方法两种分离纯化的方法 培养基的分类和成分培养基的分类和成分根据物理性质分类：根据物理性质分类：凝固剂凝固剂（琼脂琼脂）用途用途固体培养基固体培养基有有用于微生物的分离、鉴定、计数等用于微生物的分离、鉴定、计数等液体培养基液体培养基无无常用于工业生产及扩大培养等常用于工业生产及扩大培养等根据培养基的用途分类：根据培

8、养基的用途分类：用途用途例例选择培养选择培养基基加入某种化学物质：加入某种化学物质：抑制不需要的微生物生长，抑制不需要的微生物生长，或满足所需要微生物的特殊营养要求或满足所需要微生物的特殊营养要求 加加青霉素青霉素分离到分离到酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源分离到分离到以尿以尿素为氮源的微生物素为氮源的微生物鉴别培养鉴别培养基基加入某种指示剂或化学药品加入某种指示剂或化学药品 伊红和美蓝伊红和美蓝 鉴别大肠杆菌鉴别大肠杆菌如何分离固氮菌？分离自养型微生物？如何分离固氮菌？分离自养型微生物？培养基的分类和成分培养基的分类和成分培养基是适合微生物生长繁殖的营养基质，一般包括

9、培养基是适合微生物生长繁殖的营养基质，一般包括水、无机水、无机盐、碳源、氮源、生长因子盐、碳源、氮源、生长因子。微生物培养微生物培养植物组织培养植物组织培养自养自养异养异养水分水分水水水水水水无机盐无机盐无机盐无机盐无机盐无机盐无机盐无机盐碳源碳源CO2、NaHCO3等碳酸盐等碳酸盐氮源氮源铵盐、硝铵盐、硝酸盐酸盐生长因子生长因子无无特殊添加物特殊添加物 无无无无糖类：葡萄糖、蔗糖、淀粉糖类：葡萄糖、蔗糖、淀粉等；蛋白质、核酸类：牛肉等；蛋白质、核酸类：牛肉膏、膏、蛋白胨蛋白胨、花生粉饼、明、花生粉饼、明胶、氨基酸等胶、氨基酸等牛肉膏、牛肉膏、蛋白胨蛋白胨、尿素、氨、尿素、氨基酸等基酸等酵母提

10、取液酵母提取液、豆芽汁类：、豆芽汁类：维生素、酶、碱基等维生素、酶、碱基等蔗糖等有机物蔗糖等有机物氨基酸等小分子氨基酸等小分子有机物有机物维生素类维生素类生长素、细胞分裂素生长素、细胞分裂素培养不同的微生物，所需成分、酸碱度不同：培养不同的微生物，所需成分、酸碱度不同：“细菌喜荤，霉菌喜素细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌中性；细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸。偏碱，霉菌中性偏酸。灭菌灭菌是指用是指用强烈强烈的理化方法的理化方法 ，杀死一定环境中，杀死一定环境中所有所有微生物的微生物的细胞、芽孢和孢子。细胞、芽孢和孢子。消毒消毒是指用较为是指用较为温和温和的理化方法的理化方法 ，杀死，杀死部分部分微生物，不

11、杀死微生物，不杀死芽孢和孢子芽孢和孢子 。（1 1）煮沸消毒法（）煮沸消毒法（100100煮沸煮沸5-6min5-6min）：一般物品）：一般物品（2 2）巴氏消毒法（）巴氏消毒法（70-75 70-75 煮煮30min30min）：不耐高温的液体，如牛奶）：不耐高温的液体，如牛奶（3 3）化学药剂消毒法（）化学药剂消毒法（70%75%70%75%酒精）：擦拭双手酒精）：擦拭双手（1 1）灼烧灭菌法（酒精灯火焰）：）灼烧灭菌法（酒精灯火焰）：接种环接种环，操作时试管口，操作时试管口（2 2）干热灭菌法（）干热灭菌法（160-170160-1701-2h1-2h）：其他金属工具）：其他金属工具（

12、3 3）高压蒸汽灭菌法（）高压蒸汽灭菌法（1kg/cm1kg/cm2 2的压力下，的压力下，12115min12115min）：）：培养基培养基及试管、及试管、培养皿培养皿、三角瓶等。、三角瓶等。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，可在如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，可在90以上以上(500g/cm2压力压力)的高压蒸气锅中灭菌的高压蒸气锅中灭菌30min。（4 4）紫外线和过滤风灭菌：超洁净工作台）紫外线和过滤风灭菌：超洁净工作台（5 5）过滤灭菌法（）过滤灭菌法（G6G6玻璃砂漏斗玻璃砂漏斗）：尿素溶液）：尿素溶液无菌技术：消毒、灭菌无菌技术：消毒、灭菌无菌操作的要求无

13、菌操作的要求:(1)各种器皿必须是无菌的各种器皿必须是无菌的(2)各种培养基必须是无菌各种培养基必须是无菌(3)转移操作的过程及其它环境也应是无菌的转移操作的过程及其它环境也应是无菌的为什么要灭菌？为什么要灭菌？若混有杂菌，将与菌种形成竞争关系，影响菌种的若混有杂菌，将与菌种形成竞争关系，影响菌种的生长或不能分离到所需的微生物。生长或不能分离到所需的微生物。在培养微生物时必须进行在培养微生物时必须进行无菌操作无菌操作。培养基的配制培养基的配制高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌称量称量溶化溶化调调pH分装分装氯化钠氯化钠0.50.5克克蛋白胨蛋白胨0.50.5克克酵母提酵母提取物取物0.250.25克克将

14、上述物质溶解后，添加自将上述物质溶解后，添加自来水，定溶至来水，定溶至50mL50mL。大肠杆菌的大肠杆菌的LBLB液体液体培养基培养基步骤步骤1 1：大肠杆菌的：大肠杆菌的LBLB培养基配制及相培养基配制及相关器具和培养基的灭菌关器具和培养基的灭菌加封口膜加封口膜超净台灭菌超净台灭菌酒精消毒桌、手酒精消毒桌、手酒精灯旁操作酒精灯旁操作步骤步骤2 2：细菌以：细菌以“二分裂二分裂”的方式繁殖，约的方式繁殖，约20min20min分分裂一次，在液体培养基进行扩大培养。裂一次，在液体培养基进行扩大培养。步骤步骤3 3：用划线分离法进行分离纯化。：用划线分离法进行分离纯化。接种方法接种方法接种后的培

15、养接种后的培养基类型基类型接种后培接种后培养的时间养的时间培养结果培养结果细菌的细菌的培养培养接种环直接接种接种环直接接种3737，摇床，摇床液体培养基液体培养基12h12h假如从一假如从一个细胞开个细胞开始，始，2 22424细菌的细菌的分离分离用接种环在培养用接种环在培养基上用划线的方基上用划线的方式接种式接种固体培养基固体培养基10-20h10-20h形成若干形成若干个菌落个菌落LB固体固体培养基培养基需加需加琼脂琼脂1 1克。克。计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。步骤步骤4 4：划线分离法需要制作固体培养基（倒平板）。：划线分离法需要制作固体培养基（倒平板

16、）。l超净台的环境下操作！超净台的环境下操作！l在冷却到在冷却到60时倒平板！时倒平板！两种分离纯化的方法：划线分离法，两种分离纯化的方法：划线分离法，涂布分离法涂布分离法划线分离法划线分离法1 1、划线分离法、划线分离法方法：方法：用烧红后冷却的接种环蘸取带菌的液体培养用烧红后冷却的接种环蘸取带菌的液体培养物，在固体培养基的平板上划线。物，在固体培养基的平板上划线。原理：原理：微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经培养后，可在平板表面得少，并逐步分散开来，经培养后，可在平板表面得到单菌落到单菌落。2 2、涂布分离法、涂布分离法方法：

17、方法：将培养的菌液稀释，通常稀释将培养的菌液稀释，通常稀释10-510-7倍。取倍。取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基的平面上，然后进行培养。刮刀涂布在培养基的平面上，然后进行培养。在某个稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，通常以每在某个稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，通常以每个培养皿中有个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。个以内的单菌落最为合适。划线分离法：方法简单。划线分离法：方法简单。涂布分离法：单菌落更易分开，但操作复杂些。涂布分离法：单菌落更易分开，但操作复杂些。单菌落的分离是消除污

18、染杂菌的通用方法，也是用单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离法划线分离法涂布分离法涂布分离法实验小结实验小结操作细节的思考操作细节的思考一、实验内容一、实验内容 1 1、用、用LBLB液体培养基液体培养基扩大扩大培养大肠杆菌。培养大肠杆菌。2 2、在固体平面培养基上划线进行、在固体平面培养基上划线进行分离分离。二、操作细节二、操作细节 1 1、倒平板时，为什么需使锥形瓶瓶口通过火焰？接种操作、倒平板时，为什么需使锥形瓶瓶口通过火焰？接种操作为什么要在火焰旁进行？为什么要在火焰旁进行？空气中存在有大量的微生物

19、，而接种灯的火焰旁能形成一空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌的区域，在这里操作，可以避免杂菌的污染。个无菌的区域，在这里操作，可以避免杂菌的污染。2 2、如何使接种环冷却后再挑取菌体？为什么要冷却？、如何使接种环冷却后再挑取菌体？为什么要冷却？让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。以免接种让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。以免接种环温度太高环温度太高,杀死菌种。杀死菌种。3 3、为什么在划线分离法操作时，第一步要灼烧接种环？、为什么在划线分离法操作时，第一步要灼烧接种环？为了避免接种环上可能存在的微生物造成污染。为了避免接种环上可能存在的微生物造成污染。4 4

20、、若用分离划线的方法，为什么每次划线前都要灼烧接种环？、若用分离划线的方法，为什么每次划线前都要灼烧接种环？为了杀死上次划线结束后，接种环上残为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使一次划线时，接种环上的留的菌种，使一次划线时，接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，从而通菌种直接来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目减少，以便得到单菌落。的数目减少，以便得到单菌落。5 5、为什么在划线操作结束时仍需灼烧接种环？、为什么在划线操作结束时仍需灼烧接种环？及时杀死接种环上残留菌种及时杀死接种环上残留菌种,避免细菌污染环境和感染操作者

21、。避免细菌污染环境和感染操作者。6 6、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒放恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸汽所凝结的水滴留在盖上；如果正放培养皿，培养皿则会使水蒸汽所凝结的水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。则菌落中的则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。分离的目的。在酒精灯火焰旁，将单菌落用灭菌的

22、接种环取出，用划线法在酒精灯火焰旁，将单菌落用灭菌的接种环取出，用划线法接种在斜面上，接种在斜面上，37恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养24h后后,置于置于4 冰箱中冰箱中保存。保存。7 7、分离纯化后的大肠杆菌如何保存、分离纯化后的大肠杆菌如何保存?9 9、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。是培养基。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。8 8、接种斜面画线时要注意什么？、接种斜面画线时要注意什么？(1)

23、由里向外画，由里向外画，(2)线条要细且密；线条要细且密；(3)不要重复划线，不要重复划线，(4)不要画破培养基，不不要画破培养基，不要接触到管壁或管口。要接触到管壁或管口。下列关于微生物培养基的说法中，正确的是下列关于微生物培养基的说法中，正确的是A.A.同一种物质不可能既作碳源又做氮源同一种物质不可能既作碳源又做氮源B.B.凡是碳源都能提供能量凡是碳源都能提供能量C.C.除水以外的无机物仅提供无机盐除水以外的无机物仅提供无机盐D.D.无机氮也能提供能量无机氮也能提供能量解析：对于异养微生物来说，含解析：对于异养微生物来说，含CHONCHON的有机化合物既是碳源，的有机化合物既是碳源，又是氮源；又是氮源；CO2CO2是光能自养细菌的碳源，但不能直接提供能是光能自养细菌的碳源，但不能直接提供能量；量；CO2CO2和和N2N2是自养微生物的碳源和氮源；硝化细菌所利用是自养微生物的碳源和氮源；硝化细菌所利用的氮源是氨；同时氨也能提供化能合成作用的能源。的氮源是氨；同时氨也能提供化能合成作用的能源。