植物体细胞胚胎发生.ppt

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1、第十二章 植物体细胞胚胎发生n n第一节第一节 体细胞胚胎发生的方式体细胞胚胎发生的方式 n n第二节第二节 影响体细胞胚胎发生的因素影响体细胞胚胎发生的因素 n n第三节第三节 体细胞胚胎发生中基因表达与调控体细胞胚胎发生中基因表达与调控 第一节 体细胞胚胎发生的方式 植物体细胞胚（plant somatic embryos）：在离体培养过程中由植物外植体 或愈伤组织产生与受精 卵发育方式类似的胚胎 结构现象。一、体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis）的特点*植物的胚胎发生是从合子开始的。*单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（p

2、ollen embryogenesis）*合子发育的胚胎为二倍体的体细胞产生的胚状结构*体细胞胚胎是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos），可发育成单倍体植株。花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子胚无融合生殖胚*体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构，包括以下几点含义：1 1、体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚，只限于在组织培养范围使用；2 2、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；3、体细胞胚形成经历胚胎发育过程，区别

3、于组织培养的器官发生中芽与根的分化。二 体细胞胚发生意义植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比 具有明显的特点：1具有两极性 2存在生理隔离 3遗传性相对稳定 4重演受精卵形态发生的特性 (A)伸长期合子；(B)合子经过第一次分裂,产生1 个顶细胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C)四分体胚:顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D)16 细胞球形胚:8 细胞胚的所有细胞经过1 次平周分裂,产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E)早期心形胚；(F)心形胚:子叶和胚根原基已经出现；(G)成熟胚胎。1:顶细胞;2:基细胞;3:胚根原细胞,形成未来的

4、ROC 和根冠中央区;RM:根尖生长点;SM:茎尖生长点 图6.2 双子叶植物拟南芥的胚胎发育过程第二节第二节 影响体细胞胚胎发生的因素影响体细胞胚胎发生的因素 1 1、基因型与体细胞胚发生、基因型与体细胞胚发生 基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异 （a）不同基因型体细胞胚诱导率；（b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目 图6.7 在相同培养基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型体细胞胚诱导（引自Miguel

5、等，2001）n n2 2、植物激素与体细胞胚发生、植物激素与体细胞胚发生 n n*离体植物细胞在开始离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过程中又必需化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种生长素和细胞分裂素两种激素的共同作用。激素的共同作用。n n*在培养介质中在培养介质中添加不同种类或不同浓度的外源激素添加不同种类或不同浓度的外源激素诱诱导形态发生已受到广泛的重视。导形态发生已受到广泛的重视。n n*但但最关键最关键的是的是组织内部和体

6、细胞胚发生部位的内源激组织内部和体细胞胚发生部位的内源激素代谢动态和平衡素代谢动态和平衡。n n（1）、内源激素与体细胞胚发生 n n 早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发现，早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发现，2 2，4-D4-D在诱导胚性细胞早期是必需的，而且在诱导胚性细胞早期是必需的，而且2 2，4-4-D D是通过影响是通过影响IAAIAA结合蛋白起作用，其实质是促进结合蛋白起作用，其实质是促进IAAIAA结合蛋白的形成，提高细胞对结合蛋白的形成，提高细胞对IAAIAA的敏感性从的敏感性从而诱导胚性细胞的形成。而诱导胚性细胞的形成。n n（2）外源激素与体细胞胚发生 n n 2

7、 2，4-D4-D与体细胞胚发生与体细胞胚发生 n n2 2，4-D4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的重要激素。重要激素。n n单子叶植物和双子叶植物诱导体细胞胚胎发生时，所要求单子叶植物和双子叶植物诱导体细胞胚胎发生时，所要求的的2,4-D2,4-D的浓度不同，对单子叶植物而言，一般要求较高的浓度不同，对单子叶植物而言，一般要求较高浓度的浓度的2,4-D2,4-D，其浓度范围为，其浓度范围为0.5-5mg/L0.5-5mg/L，通常使用浓度为，通常使用浓度为2mg/L2mg/L；n n而对双子叶植物而言，一般要求较低浓度的而对双子叶

8、植物而言，一般要求较低浓度的2,4-D2,4-D，其浓，其浓度范围为度范围为0.02-1mg/L0.02-1mg/L，通常使用的浓度为，通常使用的浓度为0.1mg/L0.1mg/L。A,C,E为离体培养6周后的体细胞胚；B,D,F为离体培养5个月后形成的体细胞胚 A:品种GK7，在添加83.0 mM centrophenoxine培养基上;B:品种AT120，在添加124.4 mM centrophenoxine培养基上;C:品种59-4144，在添加12.4 mM dicamba培养基上;D:品种AT120，在添加83.0 mM dicamba培养基上;E:品种VC1，在添加83.0 mM

9、picloram培养基上;and F:品种VC1，在添加124.4 mM picloram培养基上.图图图图 含不同种类和不同浓度生长含不同种类和不同浓度生长含不同种类和不同浓度生长含不同种类和不同浓度生长素固体培养基上成熟花生胚轴体素固体培养基上成熟花生胚轴体素固体培养基上成熟花生胚轴体素固体培养基上成熟花生胚轴体细胞胚诱导细胞胚诱导细胞胚诱导细胞胚诱导 n n 其它生长激素与体细胞胚发生其它生长激素与体细胞胚发生 n n除除2,4-D2,4-D外，外，ABAABA对植物体细胞胚的发生也起到重要的调控对植物体细胞胚的发生也起到重要的调控作用。作用。n n研究表明，研究表明，ABAABA具有促

10、进苈蒿体细胞胚结构正常化的显著具有促进苈蒿体细胞胚结构正常化的显著效应。效应。n n在浓度适宜时，在浓度适宜时，ABAABA能抑制多种异常体细胞胚的发生，而能抑制多种异常体细胞胚的发生，而且且ABAABA加入培养基的时间愈早其效应也越明显。加入培养基的时间愈早其效应也越明显。n n较低浓度的较低浓度的ABAABA对保持籼稻愈伤组织的胚性结构具有重要对保持籼稻愈伤组织的胚性结构具有重要意义，可明显提高这种胚性愈伤组织分化出苗率。意义，可明显提高这种胚性愈伤组织分化出苗率。n n在拐芹中在拐芹中ABAABA与与NAANAA共同作用可诱导一些游离氨基酸含量的共同作用可诱导一些游离氨基酸含量的变化和特

11、异蛋白的形成。变化和特异蛋白的形成。n nABAABA和和PEGPEG对胡萝卜对胡萝卜(DaucusDaucus carotacarota L.)L.)体细胞胚发生具有体细胞胚发生具有调控作用调控作用 （3）多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和乙烯与体细胞胚发生*外源多胺对体胚发生的作用除了取决于植物种类及其内源多胺的状况之外，还关系到它们如何被吸收、运输及降解等问题。多胺与体细胞胚发生的关系在胡萝卜的研究中较多。金属离子*金属离子对体细胞胚的发生也有影响。*在小麦愈伤组织诱导体细胞胚发生中也发现Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等金属离子具有重要的促进作用，不仅可提高诱导频率，

12、而且还可以加速胚性愈伤组织的形成，因此，在培养基中加入适合浓度金属离子可提高体细胞胚发生的频率。*有研究表明，金属离子可能是通过促进多胺合成而提高体细胞胚发生频率。二、外植体与体细胞胚发生的影响 不同基因型、外植体体细胞胚发生能力不同。如胡萝卜子叶不同部位培养诱导的发育过程不同。只有表皮下细胞具有真正细胞全能性和有能力直接产生体细胞胚（胚胎发生区），而不用通过愈伤组织阶段的诱导。表皮下细胞 根发生区细胞 芽发生区细胞 胡萝卜子叶不同部位外植体示意图三 光与体细胞胚发生品种JackJack（光照强度50-60 E m2 s-1）品种 FayetteFayette（光照强度50-60 E m2 s

13、-1）品种JackJack（光照强度5-10 E m2 s-1）品种FayetteFayette（光照强度5-10 E m2 s-1）(图 光对大豆不同品种子叶体细胞胚发生的影响)一、体细胞胚发生的生化基础 近年来，随着植物组织培养技术的提高，在植物体细胞胚发生的全能性表达过程中，人们早已不局限于形态学和细胞胚胎学的直观描述，而是在这些观察的基础上，紧密结合细胞胚胎学过程研究生理生化机制，以探讨体细胞胚发生的分子基础，其中体细胞胚形成过程中蛋白质和酶的动态变化，为最终揭示体细胞胚发生机制奠定基础。第三节 体细胞胚发生的生化基础及影响 体细胞胚胎发生的因素（一）、ATP酶活性的提高*在枸杞的胚性

14、细胞早期，ATP酶反应产物主要沉积于质膜和液泡膜上，尤其是在质膜上的ATP酶活性高，且呈连续分布。在胚性细胞后期，ATP酶活性从细胞质逐渐转入细胞内，在细胞质、液泡和细胞核中均有ATP酶活性反应。*进一步表明ATP酶活性是在胚性细胞发生过程中形成的。*这种ATP酶活性的存在又可能为胚性细胞的分裂和发育提供能量，或者与物质和信息的传递密切相关。（二）、过氧化物酶和其它酶类*体细胞胚发生和发育是大量酶特异性合成及参与代谢的结果。*体细胞胚发生和发育过程中具有较高的过氧化物酶活性和较多的同工酶种类。举例：*如过氧化物酶在小麦体细胞胚发生中起着重要的作用，特别是C2、C6、C9三种三种同工酶带是胚胎发

15、生的特异性酶带，被称为小麦体细胞胚发生的标志酶。*在大麦的形态发生中分析几种酶的同工酶，结果发现过氧化物酶、酯酶和酸性磷酸酶同工酶的结合应用，可以作为体细胞胚发生的标志酶。*近年来在枸杞的体细胞胚发生中，还发现超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD或POX）和过氧化氢酶（CAT）等几种抗氧化酶的活性在胚胎发生与发育过程中有特异性变化，表明体细胞胚发生也与超氧化物自由基的清除有关。（三）、体细胞胚发生过程中，存在着活跃的蛋白质合成，而且这些蛋白质合成为体细胞胚发生和发育奠定了分子基础*有关体细胞胚发生中可溶性蛋白质含量的变化已有大量研究报道，尽管有些结果不仅相同，但变化的趋势是相近的。在可

16、溶性蛋白质含量上，各类材料中胚性愈伤组织的蛋白质含量和合成速率远高于非胚性愈伤组织，表明前者代谢高于后者。（四）、体细胞胚发生中特异的胚性蛋白质的形成*体细胞胚发生中不仅有蛋白质含量的变化，而且有特异的胚性蛋白质的形成，推测这些胚性蛋白既可作为调控因子，又可作为结构蛋白、贮藏蛋白和酶蛋白起作用。（五）、RNA代谢动态*RNA的合成是胚性细胞发生的分子基础，也是体细胞胚正常发育的重要条件。在体细胞胚发生和发育过程中不仅RNA合成速率远高于非胚性愈伤组织，而且mRNAmRNA种类丰富种类丰富、不同发育时期mRNA种类不同，因而转译形成多种蛋白质。此外，这些mRNA的cDNA文库是研究胚胎发生与发育

17、分子机制有效的分子探针。*Sengupta等早在20世纪80年代初就发现，胡萝卜体细胞胚发生中，RNARNA合合成成始始于于胚胚性性细细胞胞培培养养的的2-42-4小小时时，两天后细胞分裂较快，总RNA和蛋白质含量增加，而且在胚性细胞中主要合成poly(A)+mRNA，并认为它的出现是体细胞胚分化的重要遗传信息。（六）、DNA代谢动态 DNA代谢动态与体细胞胚的形态学极性密切有关，它的合成为细胞分裂奠定了物质基础，为细胞分化提供了条件。二、体细胞胚发生中基因表达的调控*植物体细胞胚胎发生是一种特定细胞分化的结果，而特定细胞分化则是基因选择表达或受控表达的结果。因此，基因表达的调控是细胞正常生长

18、、发育和分化的基础，也与生物体对环境的适应有密切的关系。*真核基因表达调控包括：1、转录前的调控，如基因扩增、基因重排及DNA甲基化等；2、转录调控；3、转录后调控，如RNA剪切、mRNA从细胞核向细胞质的选择运输、RNA编辑等；4、翻译调控；5、翻译后调控，如蛋白质修饰等。（一）、体细胞胚发生中基因表达的激素调控*植物体细胞胚发生与激素关系密切，有些激素（2,4-D）对禾谷类植物的体细胞胚发生具有决定性作用。1、细胞分裂素对基因表达的调控*有研究表明，细胞分裂素能直接调控细胞核基因的活性，此外，还调控蛋白质的磷酸化以及调控蛋白质的翻译，进而调控体细胞胚的形成。2、生长素对基因表达的调控*60

19、年代初Key等人提出“基因表达活化”假说，认为生长素调解生长过程所必需的蛋白质合成的mRNA形成。*最近有研究表明，植物生长素能诱导mRNA的合成，而且能调控细胞内mRNA的含量水平。*在苜蓿的体细胞胚发生的研究中,证明2,4-D可以诱导编码富含脯氨酸的小分子蛋白质基因（MsPRP5）的 表达，在脱分化的愈伤组织中MsPRP5 mRNA的积累与2,4-D的浓度有关，100mol/L的2,4-D处理愈伤组织20min，mRNA的量开始增加，处理24-48h mRNA的量达到高峰（Gyorgyey等，1997）。(三)、蛋白质磷酸化与基因表达*蛋白质的磷酸化和去磷酸化在蛋白质因子的激活、基因转录的

20、调解中起重要作用。*在植物的发育和代谢调控中，蛋白质的磷酸化起重要的作用，蛋白质的磷酸化可通过蛋白质构象的变化来激活或改变蛋白质的功能.Olah等（1989）发现苜蓿的培养物中有一种50kDa蛋白，这种蛋白可被Ca2+和自身的磷酸化作用激活，这种蛋白是一种Ca2依赖性的蛋白质激酶，但它的功能还不清楚。（四）、体细胞胚发生中DNA的甲基化对基因表达的调控作用*DNA甲基化有许多重要的生物学功能，包括DNA复制起始、突变、限制修饰系统、基因表达调控及组织分化等。*DNA甲基化主要发生在胞嘧啶C上，特别是在鸟嘌呤G旁边的C上，CpG上的C是最容易甲基化的位点：5-GCm-3。*Loschiava等（

21、1989）研究表明，2,4-D与DNA甲基化有关，当胡萝卜悬浮培养物在含高浓度的2,4-D的培养条件下，核DNA的甲基化从16增加到45；核DNA甲基化的增加，表明对基因的抑制作用增强；当去除2,4-D并降低细胞密度时，核DNA便去甲基化。拟南芥体细胞胚诱导系统A.Freshly isolated protoplasis.B.First mitotic division 72 h after isolation.C.Developed divesions.D.Microcolonies 7 days after isolation.Fig.1.Multicellular colony deve

22、lopment in Medicago sativa CULTIVAR Semit 921 cotyledon-dereved protoplast culturesE-F.Callus presenting embryoid-like structures derived from leaf protoplasts of Medicago sativa Rangelander,and embryo gemination.G-H.Whole plantlets after 60 and 90 days on half-strength MS medium.Fig.1.Multicellular colony development in Medicago sativa CULTIVAR Semit 921 cotyledon-dereved protoplast cultures本章要点：*掌握植物体细胞胚胎发生方式、起源、特点及其调控，了解体细胞转变为胚性细胞的机制以及体细胞胚胎发生基因表达与调控。