《核酸测序技术》PPT课件.ppt

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1、核酸测序技术核酸测序技术基因工程研究所基因工程研究所 人类基因组计划（人类基因组计划（Human Genome ProjectHuman Genome ProjectHGPHGP）于）于19901990年正式启动，其主要目标有：识别年正式启动，其主要目标有：识别人类人类DNADNA中所有基因（超过中所有基因（超过1010万个）；测定组成万个）；测定组成人类人类DNADNA的的3030亿碱基对的序列亿碱基对的序列；将这些信息储存；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。解决该计划可能引发的伦理、法

2、律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了科学工程，它奠定了2121世纪生命科学发展和现代世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。意义和商业上的巨大价值。杂交测序法杂交测序法质谱法质谱法单分子测序法单分子测序法原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法、大规模平行实测法、DNADNA芯片法芯片法 经典方法经典方法新技术方法新技术方法SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sange

3、r(Sanger和和Coulson1977)Coulson1977)Maxam-Gilbert DNAMaxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam(Maxam 和和Gilbert,1977)Gilbert,1977)SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法n nSangerSangerSangerSanger于于于于1977197719771977年年年年在在在在加加加加减减减减法法法法测测测测序序序序的的的的基基基基础础础础上上上上创创创创建建建建了了了了 双双双双 脱脱脱脱 氧氧氧氧 链链链链 末末末末 端端端端 合合合合 成成成成 终终终终 止止止止 法

4、法法法（chain chain chain chain termination termination termination termination methodmethodmethodmethod），简简简简称称称称SangerSangerSangerSanger法法法法、双双双双脱氧法或酶法。脱氧法或酶法。脱氧法或酶法。脱氧法或酶法。一、基本原理一、基本原理n n利利利利用用用用DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，以以以以待待待待测测测测单单单单链链链链DNADNADNADNA为为为为模模模模板板板板，以以以以dNTPdNTPdNTPdNTP为为为为底底底底物物物物，设设设

5、设立立立立四四四四种种种种相相相相互互互互独独独独立立立立的的的的测测测测序序序序反反反反应应应应体体体体系系系系，在在在在每每每每个个个个反反反反应应应应体体体体 系系系系 中中中中 加加加加 入入入入 不不不不 同同同同 的的的的 双双双双 脱脱脱脱 氧氧氧氧 核核核核 苷苷苷苷 三三三三 磷磷磷磷 酸酸酸酸（dideoxyribonucleoside dideoxyribonucleoside dideoxyribonucleoside dideoxyribonucleoside triphosphatetriphosphatetriphosphatetriphosphate，ddNTP

6、ddNTPddNTPddNTP）作作作作为为为为链链链链延延延延伸伸伸伸终终终终止止止止剂剂剂剂。在在在在测测测测序序序序引引引引物物物物引引引引导导导导下下下下，按按按按照照照照碱碱碱碱基基基基配配配配对对对对原原原原则则则则，每每每每个个个个反反反反应应应应体体体体系系系系中中中中合合合合成成成成一一一一系系系系列列列列长长长长短短短短不不不不一一一一的的的的引引引引物物物物延延延延伸伸伸伸链链链链，通通通通过过过过高高高高分分分分辨辨辨辨率率率率的的的的变变变变性性性性聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离，放放放放射射射射自自自自显显显

7、显影影影影检检检检测测测测后后后后，从从从从凝凝凝凝胶胶胶胶底底底底部部部部到到到到顶顶顶顶部部部部按按按按53535353方方方方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列 。双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的双脱氧链终止法的测序基础测序基础测序基础测序基础是以是以是以是以双脱氧核苷三磷双脱氧核苷三磷双脱氧核苷三磷双脱氧核苷三磷酸酸酸酸为测序反应的链终止剂。为测序反应的链终止剂。为测序反应的链终止剂。为测序反应的链终止剂。POHdNTPddNTP

8、 POHOH P P P POHn n在在在在4 4 4 4组组组组相相相相互互互互独独独独立立立立的的的的测测测测序序序序反反反反应应应应体体体体系系系系中中中中，分分分分别别别别加加加加入入入入四四四四种种种种不不不不同同同同ddNTPddNTPddNTPddNTP，其其其其余余余余成成成成分分分分相相相相同同同同。调调调调整整整整每每每每个个个个测测测测序序序序反反反反应应应应中中中中dNTPdNTPdNTPdNTP与与与与ddNTPddNTPddNTPddNTP的的的的比比比比例例例例，使使使使引引引引物物物物的的的的延延延延伸伸伸伸在在在在对对对对应应应应于于于于待待待待测测测测模模

9、模模板板板板DNADNADNADNA每每每每个个个个可可可可能能能能掺掺掺掺入入入入的的的的位位位位置置置置都都都都有有有有可可可可能能能能发发发发生终止。生终止。生终止。生终止。n n产产产产生生生生4 4 4 4组组组组分分分分别别别别终终终终止止止止于于于于互互互互补补补补链链链链3333末末末末端端端端的的的的每每每每一一一一个个个个A A A A、G G G G、C C C C和和和和T T T T位位位位置置置置上上上上的的的的一一一一系系系系列列列列长长长长度度度度的的的的核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸链链链链。通通通通过过过过高高高高分分分分辨辨辨辨率率率率变变变变性性性性聚聚聚聚丙

10、丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳和和和和放放放放射射射射自显影检测，直接读出新合成自显影检测，直接读出新合成自显影检测，直接读出新合成自显影检测，直接读出新合成DNADNADNADNA链的序列。链的序列。链的序列。链的序列。双脱氧链末端终止法测序原理示意图双脱氧链末端终止法测序原理示意图 二、测序反应体系的组成二、测序反应体系的组成（一）待测模板（一）待测模板（一）待测模板（一）待测模板1 1 1 1单链模板单链模板单链模板单链模板DNA DNA DNA DNA n nSangerSangerSangerSanger法法法法使使使使用用用用的的的的经经经经典典典典

11、测测测测序序序序反反反反应应应应是是是是将将将将待待待待测测测测DNADNADNADNA片片片片段段段段克克克克隆隆隆隆于于于于M13mpM13mpM13mpM13mp载载载载体体体体中中中中，得得得得到到到到单单单单链链链链的的的的DNADNADNADNA模模模模板板板板，再再再再按按按按SangerSangerSangerSanger法进行测序。法进行测序。法进行测序。法进行测序。2 2 2 2双链模板双链模板双链模板双链模板DNA DNA DNA DNA n n将将将将待待待待测测测测的的的的DNADNADNADNA片片片片断断断断克克克克隆隆隆隆到到到到质质质质粒粒粒粒载载载载体体体体

12、上上上上，得得得得到到到到含含含含待待待待测测测测DNADNADNADNA克克克克隆隆隆隆片片片片断断断断的的的的双双双双链链链链质质质质粒粒粒粒，通通通通过过过过碱碱碱碱变变变变性性性性处处处处理理理理，再再再再与与与与寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸引引引引物物物物序序序序列列列列一一一一起起起起退退退退火火火火，然然然然后后后后按按按按SangerSangerSangerSanger法进行测序。法进行测序。法进行测序。法进行测序。n nPCRPCRPCRPCR产物产物产物产物（二）引物（二）引物（二）引物（二）引物n n在在在在DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶催催催催化化

13、化化的的的的测测测测序序序序反反反反应应应应中中中中需需需需要要要要测测测测序序序序引引引引物物物物。不不不不论论论论是是是是单单单单链链链链DNADNADNADNA模模模模板板板板，还还还还是是是是双双双双链链链链DNADNADNADNA模模模模板板板板，都都都都可可可可通通通通过过过过使使使使用用用用克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点两两两两侧侧侧侧的的的的载载载载体体体体序序序序列列列列互互互互补补补补的的的的“通通通通用用用用”引物。引物。引物。引物。n n通用引物的长度一般为通用引物的长度一般为通用引物的长度一般为通用引物的长度一般为1515151530303030个核苷酸。个核苷酸。

14、个核苷酸。个核苷酸。（三）（三）（三）（三）DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶1 1 1 1大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶I I I I大片段（大片段（大片段（大片段（KlenowKlenowKlenowKlenow片段）片段）片段）片段）n n KlenowKlenowKlenowKlenow片片片片段段段段酶酶酶酶是是是是SangerSangerSangerSanger法法法法最最最最早早早早使使使使用用用用的的的的DNADNADNADNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，具具具具有有有有53535353聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶和和和

15、和3 3 3 3 5555外外外外切切切切酶酶酶酶活活活活性性性性，但但但但它它它它催催催催化化化化链链链链延延延延伸伸伸伸反反反反应应应应的的的的能能能能力力力力较较较较差差差差，用用用用它它它它进行测序常产生较高的本底和假带。进行测序常产生较高的本底和假带。进行测序常产生较高的本底和假带。进行测序常产生较高的本底和假带。2 2 2 2测序酶（测序酶（测序酶（测序酶（sequenasesequenasesequenasesequenase）n n测测测测序序序序酶酶酶酶是是是是一一一一种种种种经经经经过过过过修修修修饰饰饰饰的的的的T7T7T7T7噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体DNADNADNAD

16、NA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，消消消消除除除除了了了了35353535外外外外切切切切酶酶酶酶活活活活性性性性。该该该该酶酶酶酶活活活活性性性性非非非非常常常常稳稳稳稳定定定定，具具具具有有有有很很很很高高高高的的的的链链链链延延延延伸伸伸伸能能能能力力力力和和和和极极极极快快快快的的的的聚聚聚聚合合合合反应速度，是测定较长反应速度，是测定较长反应速度，是测定较长反应速度，是测定较长DNADNADNADNA的首选酶。的首选酶。的首选酶。的首选酶。3 3 3 3TaqTaqTaqTaq DNA DNA DNA DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 n n TaqTaqTaqTaq DNADNADNAD

17、NA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶是是是是PCRPCRPCRPCR反反反反应应应应的的的的关关关关键键键键酶酶酶酶，在在在在95959595的的的的高高高高温温温温下下下下保保保保持持持持稳稳稳稳定定定定，可可可可在在在在高高高高温温温温下下下下进进进进行行行行反反反反应应应应，该该该该酶酶酶酶用用用用于于于于测测测测序序序序具具具具有有有有很很很很好好好好的的的的链链链链延延延延伸伸伸伸性性性性能能能能，能能能能克克克克服服服服富富富富含含含含GCGCGCGC序序序序列列列列的的的的模模模模板板板板形形形形成成成成自自自自身身身身二二二二级级级级结结结结构构构构对对对对测测测测序的影响。序的影响。

18、序的影响。序的影响。（四）放射性核素标记的（四）放射性核素标记的（四）放射性核素标记的（四）放射性核素标记的dNTPdNTPdNTPdNTPn n一般采用一般采用一般采用一般采用-32323232P-dNTPP-dNTPP-dNTPP-dNTP或或或或-35353535S-dNTPS-dNTPS-dNTPS-dNTP作为标记物。作为标记物。作为标记物。作为标记物。目前通常采用目前通常采用目前通常采用目前通常采用-35353535S-dNTPS-dNTPS-dNTPS-dNTP。（五）测序产物的凝胶电泳及识读（五）测序产物的凝胶电泳及识读（五）测序产物的凝胶电泳及识读（五）测序产物的凝胶电泳及识

19、读n n能否将测序反应中产生的各种不同长度的能否将测序反应中产生的各种不同长度的能否将测序反应中产生的各种不同长度的能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNADNADNADNA片片片片段进行有效分离是序列分析成败的关键。段进行有效分离是序列分析成败的关键。段进行有效分离是序列分析成败的关键。段进行有效分离是序列分析成败的关键。三、三、SangerSanger双脱氧链终止法的特点双脱氧链终止法的特点1.1.1.1.快速简便，一次反应可测快速简便，一次反应可测快速简便，一次反应可测快速简便，一次反应可测500500500500个以上的碱基个以上的碱基个以上的碱基个以上的碱基 序列。序列。序列。序列

20、。2.2.2.2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便荧光染料代替放射性核素标记，使该法便荧光染料代替放射性核素标记，使该法便荧光染料代替放射性核素标记，使该法便 于实现自动化分析，能够满足绝大多数于实现自动化分析，能够满足绝大多数于实现自动化分析，能够满足绝大多数于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNADNADNADNA 样品序列分析的需要。样品序列分析的需要。样品序列分析的需要。样品序列分析的需要。四、毛细管电泳四、毛细管电泳n n毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳（Capillary Capillary Capillary Capillary electrophoresis,ele

21、ctrophoresis,electrophoresis,electrophoresis,CECECECE）是是是是以以以以高高高高压压压压直直直直流流流流电电电电场场场场为为为为驱驱驱驱动动动动力力力力，在在在在毛毛毛毛细细细细管管管管内内内内使使使使荷荷荷荷电电电电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。n n具具具具有有有有分分分分辨辨辨辨率率率率高高高高、重重重重现现现现性性性性好好好好、灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高、快快快快速速速速和和和和易易易

22、易于实现自动化等优点。于实现自动化等优点。于实现自动化等优点。于实现自动化等优点。常用于常用于常用于常用于DNADNADNADNA测序的毛细管电泳形式有以下几种：测序的毛细管电泳形式有以下几种：测序的毛细管电泳形式有以下几种：测序的毛细管电泳形式有以下几种：n n（一）毛细管凝胶电泳（一）毛细管凝胶电泳（一）毛细管凝胶电泳（一）毛细管凝胶电泳n n（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳n n（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳（一）毛细管凝胶电泳（一）毛细管凝胶电泳（一）毛细管凝胶电泳

23、（一）毛细管凝胶电泳n n毛毛毛毛 细细细细 管管管管 凝凝凝凝 胶胶胶胶 电电电电 泳泳泳泳（Capillary Capillary Capillary Capillary gel gel gel gel electrophoresis,electrophoresis,electrophoresis,electrophoresis,CGECGECGECGE）是是是是将将将将平平平平板板板板电电电电泳泳泳泳的的的的凝凝凝凝胶胶胶胶移移移移到到到到毛毛毛毛细细细细管管管管中中中中做做做做支支支支持持持持物物物物进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳，由由由由于于于于电电电电场场场场强强强强度度度度比比

24、比比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25252525倍。倍。倍。倍。n nDNADNADNADNA测测测测序序序序中中中中凝凝凝凝胶胶胶胶毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳柱柱柱柱主主主主要要要要以以以以聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺凝凝凝凝胶胶胶胶作作作作筛筛筛筛分分分分介介介介质质质质，它它它它黏黏黏黏度度度度大大大大、抗抗抗抗对对对对流流流流，能能能能减减减减少少少少溶溶溶溶质质质质的的的的扩扩扩扩散散散散，有有有有极极极极好好好好的的的的分分分分离离离离效效效

25、效果果果果，除除除除用用用用于于于于DNADNADNADNA序序序序列列列列分分分分析析析析外外外外，还还还还可可可可用用用用于于于于DNADNADNADNA片片片片段段段段的的的的分分分分离离离离和和和和PCRPCRPCRPCR产产产产物物物物的分析。的分析。的分析。的分析。n n尽尽尽尽管管管管CGECGECGECGE具具具具有有有有极极极极好好好好的的的的分分分分离离离离效效效效果果果果，但但但但存存存存在在在在一一一一些些些些问问问问题题题题，如如如如制制制制备备备备凝凝凝凝胶胶胶胶柱柱柱柱费费费费力力力力，凝凝凝凝胶胶胶胶形形形形成成成成和和和和电电电电泳泳泳泳期期期期间间间间产产产

26、产生生生生的的的的气气气气泡泡泡泡影影影影响响响响分分分分离离离离，使使使使用用用用过过过过程程程程中中中中焦焦焦焦耳耳耳耳热热热热对对对对分分分分离离离离介介介介质的降解使毛细管的寿命缩短等。质的降解使毛细管的寿命缩短等。质的降解使毛细管的寿命缩短等。质的降解使毛细管的寿命缩短等。（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳（二）非凝胶基质毛细管电泳n n为为为为了了了了避避避避免免免免CGECGECGECGE存存存存在在在在的的的的问问问问题题题题，非非非非凝凝凝凝胶胶胶胶基基基基质质质质毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳用用用用于于于于DNADNA

27、DNADNA分分分分析析析析的的的的研研研研究究究究越越越越来来来来越越越越多多多多，常常常常见见见见的的的的有有有有线线线线性性性性聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺和和和和纤纤纤纤维维维维素素素素衍衍衍衍生生生生物物物物等等等等非非非非凝凝凝凝胶胶胶胶基基基基质质质质，这这这这些些些些非非非非凝凝凝凝胶胶胶胶基基基基质质质质在在在在DNADNADNADNA测测测测序序序序中中中中可可可可以以以以更更更更换换换换，使使使使毛毛毛毛细细细细管管管管的的的的寿寿寿寿命命命命延延延延迟迟迟迟，在在在在优优优优化化化化条条条条件件件件下下下下可可可可获获获获得得得得高高高高效效效效及及及及高高

28、高高速速速速的的的的分分分分离效果。离效果。离效果。离效果。（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳（三）阵列毛细管电泳n n阵阵阵阵 列列列列 毛毛毛毛 细细细细 管管管管 电电电电 泳泳泳泳（Capillary Capillary Capillary Capillary array array array array electrophoresis,electrophoresis,electrophoresis,electrophoresis,CAECAECAECAE）是是是是将将将将毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电泳泳泳泳与与与与板板板板凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳

29、泳的的的的优优优优势势势势相相相相结结结结合合合合，采采采采用用用用毛毛毛毛细细细细管管管管凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳的的的的装装装装置置置置，将将将将多多多多支支支支毛毛毛毛细细细细管管管管进进进进行行行行并并并并列列列列进进进进行行行行分分分分离离离离与与与与检检检检测测测测，以以以以板板板板凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳的的的的优优优优势势势势弥弥弥弥补补补补了了了了毛毛毛毛细细细细管管管管凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳的的的的不不不不足足足足，可一次检测多个样品。可一次检测多个样品。可一次检测多个样品。可一次检测多个样品。n n阵阵阵阵列列列列毛毛毛毛细细细细管管管管电电电电

30、泳泳泳泳散散散散热热热热效效效效率率率率高高高高，适适适适于于于于高高高高电电电电场场场场强强强强度度度度电电电电泳泳泳泳，是是是是一一一一种种种种高高高高速速速速、高高高高通通通通量量量量的的的的测测测测序序序序法法法法。使使使使用用用用非非非非凝凝凝凝胶胶胶胶基基基基质质质质，毛毛毛毛细细细细管管管管壁壁壁壁可可可可以以以以抑抑抑抑制制制制横横横横向向向向扩扩扩扩散散散散，具具具具有有有有易易易易于于于于实实实实现自动化的优点。现自动化的优点。现自动化的优点。现自动化的优点。激光测序法终止标记系统激光测序法终止标记系统激光测序法终止标记系统激光测序法终止标记系统n n激激激激光光光光测测测

31、测序序序序法法法法终终终终止止止止标标标标记记记记系系系系统统统统是是是是用用用用4 4 4 4种种种种不不不不同同同同的的的的荧荧荧荧光光光光染染染染料料料料标记不同的标记不同的标记不同的标记不同的ddNTPddNTPddNTPddNTP。五、五、DNADNA自动化测序自动化测序n n测测测测序序序序反反反反应应应应可可可可以以以以在在在在同同同同一一一一反反反反应应应应管管管管内内内内进进进进行行行行，不不不不必必必必分分分分成成成成4 4 4 4管管管管，反反反反应应应应产产产产物物物物按按按按终终终终止止止止位位位位置置置置的的的的碱碱碱碱基基基基不不不不同同同同其其其其3333末末末

32、末端端端端带带带带有有有有不不不不同同同同的的的的荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团，被被被被激激激激发发发发后后后后产产产产生生生生不不不不同同同同的的的的荧荧荧荧光光光光，将将将将反反反反应应应应产产产产物物物物加加加加样样样样于于于于凝凝凝凝胶胶胶胶的的的的同同同同一一一一加加加加样样样样孔孔孔孔，电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离后后后后，经经经经过过过过DNADNADNADNA测测测测序序序序仪仪仪仪分分分分析析析析系系系系统统统统识识识识别别别别，将将将将检检检检测测测测将将将将信信信信号号号号不不不不断断断断传传传传送送送送到到到到计计计计算算算算机机机机，通通通通过过过过软软软软件

33、件件件分分分分析析析析，自动读出待测自动读出待测自动读出待测自动读出待测DNADNADNADNA的全部核苷酸序列的全部核苷酸序列的全部核苷酸序列的全部核苷酸序列 。图图10-5 10-5 激光测序法终止标记系统测序原理示意图激光测序法终止标记系统测序原理示意图 测序仪原理测序仪原理 所谓所谓所谓所谓BigDye TerminatorsBigDye TerminatorsBigDye TerminatorsBigDye Terminators是指美国应用生物系是指美国应用生物系是指美国应用生物系是指美国应用生物系统公司专利的四色荧光分别标记的起链终止剂作统公司专利的四色荧光分别标记的起链终止剂作

34、统公司专利的四色荧光分别标记的起链终止剂作统公司专利的四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种用的四种用的四种用的四种ddNTPsddNTPsddNTPsddNTPs，与四个反应管循环测序反应，与四个反应管循环测序反应，与四个反应管循环测序反应，与四个反应管循环测序反应及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比及四个泳道电泳检测的传统双脱氧链终止法相比，实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。，实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。，实现了一个反应管完成反应与一个电泳道检测。，实现了一个反应管完成反应与一个

35、电泳道检测。由于使用了四色荧光分别标记了四种由于使用了四色荧光分别标记了四种由于使用了四色荧光分别标记了四种由于使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPsddNTPsddNTPsddNTPs，可按照四种不同荧光来分别识别可按照四种不同荧光来分别识别可按照四种不同荧光来分别识别可按照四种不同荧光来分别识别A A A A、T T T T、G G G G、C C C C，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务

36、。并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。1.1.荧光标记荧光标记2.2.循环测序循环测序3.3.电泳与结果分析电泳与结果分析 染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用谱的四种不同颜色的荧光，同时，测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的激光扫描镜头实时扫描不同大小的激光扫描镜头实时扫描不同大小的激光扫描镜头实时扫

37、描不同大小的DNADNADNADNA片段在相片段在相片段在相片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将不同大小不同大小不同大小不同大小DNADNADNADNA片段发射的荧光实时地传递给计算片段发射的荧光实时地传递给计算片段发射的荧光实时地传递给计算片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶机测序数据实时收集软件，将电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号

38、。当电泳完毕后，图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，图文件及原始数据信号。当电泳完毕后，DNADNADNADNA序序序序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，得到最终的测序结果。得到最终的测序结果。得到最终的测序结果。得到最终的测序结果。377377型遗传分析仪型遗传分析仪310310型遗传分析仪型遗传分析仪31003100遗传分析仪遗传分析仪 37303730遗传分析仪遗传分析仪 六、六、DNADNA测序策略测序策略n nDNA

39、DNADNADNA的的的的测测测测序序序序策策策策略略略略因因因因待待待待测测测测DNADNADNADNA分分分分子子子子的的的的性性性性质质质质、测测测测序序序序方方方方法法法法和和和和测测测测序序序序目目目目的的的的不不不不同同同同而而而而有有有有所所所所不不不不同同同同。在在在在测测测测序序序序之之之之前前前前，必必必必须须须须根根根根据据据据待待待待测测测测序序序序列列列列区区区区的的的的长长长长度度度度，所所所所要要要要求求求求的的的的测测测测序序序序精精精精确确确确度度度度以以以以及现有设施来制定测序总策略。及现有设施来制定测序总策略。及现有设施来制定测序总策略。及现有设施来制定测

40、序总策略。一、已知序列的确证性测序策略一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略二、未知序列的从头测序策略一、已知序列的确证性测序策略一、已知序列的确证性测序策略n n确确确确证证证证性性性性测测测测序序序序（confirmatory confirmatory confirmatory confirmatory sequencingsequencingsequencingsequencing）是是是是对对对对已已已已知的核酸序列进行鉴定和证实。知的核酸序列进行鉴定和证实。知的核酸序列进行鉴定和证实。知的核酸序列进行鉴定和证实。n n例例例例如如如如，在在在在临临临临床床床床分分分分

41、子子子子诊诊诊诊断断断断中中中中，对对对对有有有有遗遗遗遗传传传传倾倾倾倾向向向向的的的的病病病病例例例例检检检检测测测测相相相相关关关关基基基基因因因因有有有有无无无无突突突突变变变变，不不不不仅仅仅仅有有有有助助助助于于于于临临临临床床床床诊诊诊诊断断断断，还还还还有有有有助助助助于于于于探探探探索索索索有有有有关关关关疾疾疾疾病病病病的的的的发发发发病病病病机机机机理理理理及及及及基基基基因因因因突突突突变变变变引引引引起的表型的变化。起的表型的变化。起的表型的变化。起的表型的变化。n n多多多多数数数数情情情情况况况况下下下下，确确确确证证证证性性性性测测测测序序序序的的的的DNADN

42、ADNADNA片片片片段段段段较较较较小小小小，一一一一套套套套反反反反应应应应即即即即可可可可获获获获得得得得双双双双链链链链DNADNADNADNA其其其其中中中中一一一一条条条条链链链链上上上上局局局局部部部部区区区区域域域域的的的的核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列，通通通通常常常常只只只只需需需需对对对对亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆于于于于M13M13M13M13噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体或或或或噬噬噬噬菌菌菌菌粒粒粒粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序。n n

43、待待待待测测测测DNADNADNADNA片片片片断断断断位位位位于于于于通通通通用用用用引引引引物物物物的的的的测测测测序序序序范范范范围围围围之之之之内内内内时时时时，可可可可按按按按克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点两两两两侧侧侧侧的的的的载载载载体体体体序序序序列列列列设设设设计计计计和和和和合合合合成成成成寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸片片片片段段段段作作作作为为为为“通通通通用用用用引引引引物物物物”；否否否否则则则则，最最最最好好好好的的的的方方方方法法法法是是是是合合合合成成成成一一一一段段段段长长长长度度度度为为为为18-2018-2018-2018-20核核核核苷苷苷苷酸酸酸

44、酸的的的的寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸引引引引物物物物，与与与与距距距距离待测区约离待测区约离待测区约离待测区约50-10050-10050-10050-100核苷酸的序列互补。核苷酸的序列互补。核苷酸的序列互补。核苷酸的序列互补。二、未知序列的测序策略二、未知序列的测序策略n n未未未未知知知知序序序序列列列列DNADNADNADNA的的的的从从从从头头头头测测测测序序序序（de de de de novo novo novo novo sequencingsequencingsequencingsequencing）是是是是指指指指确确确确定定定定一一一一个个个个未未未未知知知知DNA

45、DNADNADNA序序序序列列列列的的的的准准准准确确确确长长长长度度度度及及及及核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸排排排排列顺序。列顺序。列顺序。列顺序。n n测测测测序序序序策策策策略略略略因因因因待待待待测测测测DNADNADNADNA的的的的长长长长度度度度而而而而异异异异，只只只只有有有有1kb1kb1kb1kb左左左左右右右右的的的的待待待待测测测测DNADNADNADNA可可可可选选选选用用用用定定定定向向向向测测测测序序序序法法法法，过过过过长长长长的的的的DNADNADNADNA可可可可选选选选用用用用随随随随机测序法。机测序法。机测序法。机测序法。（一）随机测序法（一）随机测序法n

46、n随机测序法（随机测序法（随机测序法（随机测序法（random approachrandom approachrandom approachrandom approach）包括鸟枪法与人）包括鸟枪法与人）包括鸟枪法与人）包括鸟枪法与人工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机工转座子法。其共同特点是无特定方向性，随机对靶对靶对靶对靶DNADNADNADNA进行测序，最后通过计算机拼装而得到完进行测序，最后通过计算机拼装而得到完进行测序，最后通过计算机拼装而得到完进行测序，最后通过计算机拼装而得到完整的序列信息。

47、整的序列信息。整的序列信息。整的序列信息。1 1 1 1鸟枪法鸟枪法鸟枪法鸟枪法n n鸟鸟鸟鸟枪枪枪枪法法法法（shotgun shotgun shotgun shotgun strategystrategystrategystrategy）是是是是利利利利用用用用超超超超声声声声处处处处理理理理、核核核核酸酸酸酸酶酶酶酶（DNaseDNaseDNaseDNase）切切切切割割割割或或或或限限限限制制制制性性性性酶酶酶酶切切切切割割割割，将将将将长长长长链链链链DNADNADNADNA随随随随机机机机断断断断裂裂裂裂成成成成适适适适于于于于测测测测序序序序的的的的片片片片段段段段，把把把把这这

48、这这些些些些DNADNADNADNA片片片片段段段段装装装装入入入入适适适适当当当当载载载载体体体体，建建建建立立立立亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆文文文文库库库库，含含含含有有有有子子子子片片片片段段段段的的的的亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆扩扩扩扩增增增增后后后后分分分分别别别别进进进进行行行行DNADNADNADNA序序序序列列列列测测测测定定定定，然然然然后后后后将将将将序序序序列重叠排列，确定待测列重叠排列，确定待测列重叠排列，确定待测列重叠排列，确定待测DNADNADNADNA的完整序列。的完整序列。的完整序列。的完整序列。n n该该该该法法法法所所所所获获获获得得得得的的的的序序序序列列列列

49、由由由由许许许许多多多多序序序序列列列列累累累累积积积积产产产产生生生生，结结结结果果果果准准准准确确确确。但但但但由由由由于于于于测测测测序序序序的的的的亚亚亚亚克克克克隆隆隆隆是是是是随随随随机机机机挑挑挑挑选选选选出出出出来来来来的的的的，使使使使某某某某些些些些序序序序列列列列可可可可能能能能被被被被多多多多次次次次重重重重复复复复测测测测定定定定，而而而而一一一一些些些些序序序序列列列列一一一一直直直直不不不不出出出出现现现现，通通通通常常常常要要要要测测测测定定定定比比比比实实实实际际际际靶靶靶靶DNADNADNADNA所所所所含含含含核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸多多多多4 4 4 4

50、7 7 7 7倍倍倍倍的的的的序序序序列列列列；如如如如果果果果靶靶靶靶DNADNADNADNA含含含含较较较较多多多多的的的的重重重重复复复复序序序序列列列列，计计计计算机将难以进行分析。算机将难以进行分析。算机将难以进行分析。算机将难以进行分析。（二）定向测序法（二）定向测序法n n定定定定向向向向测测测测序序序序法法法法（directed directed directed directed sequencingsequencingsequencingsequencing）是是是是指指指指从从从从待待待待测测测测DNADNADNADNA片片片片段段段段的的的的某某某某一一一一端端端端开开