细胞凋亡与检测原理.ppt

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1、 细胞凋亡与检测方法目目录 一细胞凋亡的定义二细胞凋亡的检测方法一、一、细胞凋亡的胞凋亡的检测方法方法细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡生理性凋亡生理性凋亡病理性凋亡病理性凋亡由遗传控制，受既定程序（或由遗传控制，受既定程序（或由遗传控制，受既定程序（或由遗传控制，受既定程序（或基因）调控的，是程序性的细基因）调控的，是程序性的细基因）调控的，是程序性的细基因）调控的，是程序性的细胞死亡（胞死亡（胞死亡（胞死亡（programmed cell programmed cell death,PCDdeath,PCD）非遗传控制的的意外的细胞非遗传控制的的意外的细胞坏死（坏死（accidental c

2、ell death）定义：凋亡定义：凋亡定义：凋亡定义：凋亡定义：细胞坏死定义：细胞坏死定义：细胞坏死定义：细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死细胞坏死（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）（细胞被动性死亡）细细胞胞受受到到急急性性强强力力伤伤害害时时，立立即即出出现现的的早早期期反反应应。是是是是病病病病理理理理条条条条件件件件下下下下细胞死亡的过程。细胞死亡的过程。细胞死亡的过程。细胞死亡的过程。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核核核核染染染染色色色色质质质质随随随随机机机机降降降降解解解解

3、呈呈呈呈絮絮絮絮状状状状,蛋蛋蛋蛋白白白白合合合合成减少。成减少。成减少。成减少。细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜、溶溶溶溶酶酶酶酶体体体体破破破破裂裂裂裂,细细细细胞胞胞胞内内内内容容容容物物物物流出流出流出流出,引起引起引起引起周围炎症周围炎症细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）（细胞主动性死亡）多细胞有机体为调控机体发育、维多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基持内环境稳定，由基因控制的细胞主动性死亡过程。因控制的细胞主动性死亡过程。又又又又称程序性细胞死亡称程序性细胞死亡称程序性细胞死亡称程序性细胞死亡(programmed cell

4、 death,PCD).从严格的词学意义上来说，从严格的词学意义上来说，PCD与与凋亡是有很大区别的凋亡是有很大区别的细胞坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡二、二、细胞凋亡的胞凋亡的检测方法方法形态学方法形态学方法电泳法电泳法原位缺口末端标记法原位缺口末端标记法流式细胞术测定法流式细胞术测定法(二二)形形态学方法学方法 借助普通光学借助普通光学借助普通光学借助普通光学显显微微微微镜镜，荧荧光光光光显显微微微微镜镜或透射或透射或透射或透射电电镜对镜对培养培养培养培养细细胞，胞，胞，胞，细细胞涂片或者胞涂片或者胞涂片或者胞涂片或者组织组织切片切片切片切片进进行行行行形形形形态态学学学学观观察。察。察。察

5、。细细胞凋亡的形胞凋亡的形胞凋亡的形胞凋亡的形态态特征分特征分特征分特征分为为3 3部分：部分：部分：部分：凋亡的起始凋亡的起始凋亡的起始凋亡的起始 凋亡小体的形成凋亡小体的形成凋亡小体的形成凋亡小体的形成 凋亡小体被凋亡小体被凋亡小体被凋亡小体被邻邻近近近近细细胞或吞噬胞或吞噬胞或吞噬胞或吞噬细细胞吞噬清除胞吞噬清除胞吞噬清除胞吞噬清除 下面以碧云天生物技下面以碧云天生物技下面以碧云天生物技下面以碧云天生物技术术公司生公司生公司生公司生产产的的的的细细胞凋亡胞凋亡胞凋亡胞凋亡-hoechst-hoechst染色染色染色染色试剂试剂盒盒盒盒为为例例例例碧云天生产的细胞凋亡碧云天生产的细胞凋亡碧

6、云天生产的细胞凋亡碧云天生产的细胞凋亡HoechstHoechst染色试剂盒染色试剂盒染色试剂盒染色试剂盒(Hoechst(Hoechst Staining Kit)Staining Kit)提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测提供了一种经典而又快速简便的细胞凋亡检测方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以方法。细胞发生凋亡时，染色质会固缩。所以Hoechst Hoechst 3325833258染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞

7、的细胞核呈染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。典型的状致密浓染，颜色有些发白。典型的状致密浓染，颜色有些发白。典型的状致密浓染，颜色有些发白。典型的Hoechst 33258Hoechst 33258染色后染色后染色后染色后的细胞图片参考下图。的细胞图片参考下图。

8、的细胞图片参考下图。的细胞图片参考下图。正常细胞核正常细胞核刺激后有致密浓染的刺激后有致密浓染的凋亡细胞凋亡细胞（三）（三）电泳法泳法 在在在在细细胞凋亡胞凋亡胞凋亡胞凋亡时时，内源性，内源性，内源性，内源性mg2mg2+、ca2ca2+依依依依赖赖性核算性核算性核算性核算内切内切内切内切酶酶被激活，被激活，被激活，被激活，对对DNADNA的切割有的切割有的切割有的切割有3 3种形式。即种形式。即种形式。即种形式。即核小核小核小核小体体体体间间DNADNA链链的断裂、大分子的断裂、大分子的断裂、大分子的断裂、大分子DNADNA链链的断裂以及的断裂以及的断裂以及的断裂以及DNADNA单链单链的断

9、裂的断裂的断裂的断裂。用胰。用胰。用胰。用胰酶酶消化体外培养消化体外培养消化体外培养消化体外培养细细胞，胞，胞，胞，经经PBSPBS洗洗洗洗涤涤，用蛋白，用蛋白，用蛋白，用蛋白K K消化，酚消化，酚消化，酚消化，酚-氯氯仿抽提凋亡仿抽提凋亡仿抽提凋亡仿抽提凋亡细细胞胞胞胞的基因的基因的基因的基因组组DNADNA，取，取，取，取5ug5ug琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳，紫外灯下泳，紫外灯下泳，紫外灯下泳，紫外灯下观观察可察可察可察可见见特征的特征的特征的特征的 梯状梯状梯状梯状（ladderladder）DNADNA条条条条带带。该该方法方法方法方法简简便，可定性及定量，但无法便，

10、可定性及定量，但无法便，可定性及定量，但无法便，可定性及定量，但无法显显示示示示组织细组织细胞形胞形胞形胞形态结态结构，也不能反映凋亡构，也不能反映凋亡构，也不能反映凋亡构，也不能反映凋亡细细胞与周胞与周胞与周胞与周围组织围组织的的的的关系关系关系关系 TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)(TUNEL)是一种用来是一种用来是一种用来是一种用来检测细检测细胞凋亡胞凋亡胞凋亡胞凋亡(apoptosis)(apoptosis)的的的的分析方法分析方法分析

11、方法分析方法.细细胞凋亡有一胞凋亡有一胞凋亡有一胞凋亡有一项项重要的特征重要的特征重要的特征重要的特征为细为细胞内的胞内的胞内的胞内的DNADNA碎裂成片段碎裂成片段碎裂成片段碎裂成片段(DNA fragmentation),TUNEL(DNA fragmentation),TUNEL可以有效的去探可以有效的去探可以有效的去探可以有效的去探测测DNADNA片段的片段的片段的片段的产产生生生生,所以可以所以可以所以可以所以可以传传达达达达细细胞凋亡的胞凋亡的胞凋亡的胞凋亡的讯讯息息息息.原位末端原位末端原位末端原位末端标记标记技技技技术术可以可以可以可以检测检测到形到形到形到形态态改改改改变变之

12、前的凋之前的凋之前的凋之前的凋亡亡亡亡细细胞，敏感性高，特异性胞，敏感性高，特异性胞，敏感性高，特异性胞，敏感性高，特异性强强，为为凋亡凋亡凋亡凋亡细细胞胞胞胞计计数数数数提供了基提供了基提供了基提供了基础础（四（四）原位缺口末端）原位缺口末端标记法法（五）流式（五）流式细胞胞术测定法定法 利用流式利用流式利用流式利用流式细细胞胞胞胞仪对处仪对处在快速、直在快速、直在快速、直在快速、直线线、流、流、流、流动动状状状状态态中的中的中的中的单单细细胞或者生物胞或者生物胞或者生物胞或者生物颗颗粒粒粒粒进进行多参数、快速定量分析，同行多参数、快速定量分析，同行多参数、快速定量分析，同行多参数、快速定量

13、分析，同时时对对特定群体加以分特定群体加以分特定群体加以分特定群体加以分选选的的的的现现代代代代细细胞分析技胞分析技胞分析技胞分析技术术。图为：图为：图为：图为：BECKMAN COUTER BECKMAN COUTER FLOW CYTOMETERFLOW CYTOMETER试剂盒采用赛宝生生物技术试剂盒采用赛宝生生物技术Annexin-v-FITCF凋亡检测试剂凋亡检测试剂盒盒流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构 待待测测细细胞胞以以单单个个细细胞胞的的悬悬液液，经经特特异异性性荧荧光光染染料料染染色色，放入样品管，吸入流动室。放入样品管，吸入流动室。流流动动室室充

14、充满满IsoFlow，作作用用：约约束束样样品品在在喷喷嘴嘴中中心心，防防止止样样品品靠靠近近喷喷孔孔壁壁堵堵塞塞喷喷孔孔。细细胞胞排排成成单单列列由由喷喷嘴嘴中心喷出，形成细胞液柱。中心喷出，形成细胞液柱。液柱与激光束相交，液柱与激光束相交，细胞上的胞上的荧光染料被激光染料被激发产生生荧光。光。荧光信号光信号变成成电信号信号输出到出到计算机，算机，软件分析。件分析。细胞凋亡是胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在胞的基本特征之一，它在机体的胚胎机体的胚胎发育、育、组织修复、内修复、内环境境稳定的方面起到十分重要的作用。定的方面起到十分重要的作用。Annexin V 是一种分子量在是一种分子量在35

15、-36kD的的钙离子依离子依赖性磷脂性磷脂结合合蛋白蛋白，能与，能与细胞凋亡胞凋亡过程翻程翻转到膜外的到膜外的磷脂磷脂酰丝氨酸氨酸（Phosphatidylserine,PS）高）高亲和力特异和力特异性性结合。以合。以标记FITC的的Annexin V作作为探探针，利用流式，利用流式细胞胞仪或或荧光光显微微镜可可检测细胞凋亡的胞凋亡的发生。生。PI(Propidium iodide)是一种核酸是一种核酸染料，它不能透染料，它不能透过完整的完整的细胞膜，胞膜，但在凋亡中晚期的但在凋亡中晚期的细胞和死胞和死细胞，胞，PI能能够透透过而使而使细胞核染成胞核染成红色。色。将将Annexin V 与与PI匹配使用，可以匹配使用，可以将凋亡早期的将凋亡早期的细胞和晚期的胞和晚期的细胞胞以及死以及死细胞分开。胞分开。散点图散点图 密度图密度图二维等高图二维等高图直方图直方图谢谢谢谢 请大家批评指正请大家批评指正17