生物高分子医学材料的改性和超声转染纳米含气脂质体的.pdf

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1、上海交通大学博士后学位论文生物高分子医学材料的改性和超声转染纳米含气脂质体的研究姓名：冯海申请学位级别：博士后专业：纳米生物医学材料指导教师：徐宇虹;候永泰20040601博士后出站报告中文摘要透砚质酸(H y a l u r o n i cA c i d i 以下称H A)是一种独特的线性大分子粘多糖，广泛分布在脊椎动物结缔组织细胞外基质和某些细菌当中。由葡萄糖醛酸和N 一乙酰氨基葡萄糖的双糖单位之间形成的B 糖苷键反复交替连接而成，与其它天然粘多糖不同，H A 分子内不含硫酸基因，也不与蛋自质共价结合。髓以自由链形式在体内游离存在，分子量在几百万之间。透明质酸对维持细胞间水的平衡和对细胞多

2、种连接的蛋白和C D 4 4 受体有着一定的联系。近年来，透明质酸作为一种可吸收的生物材料，已广泛应用于临床医学和化妆品开发。因为透明质酸具有的高分子量使得它的流变学特性具有粘弹性的特点能够吸收冲击力，透明质酸被用于眼科手术中维持前房深度和在治疗风湿性关节炎。风湿性关节炎是最常见的关节疾病，对关节炎的治疗主要包括减少疼痛和增加关节日常的运动性能，透明质酸能够提高关节滑液的黏性和弹性，就是所谓的粘弹性补充疗法。但是天然的透明质酸在体内降解的速度比较快，同时降解产物还容易引起炎症反应。因此通过化学交联提高它的分子量，以延长其在体内的时间是菲常重要的，我们通过研究选择了采用D V S 交联透明质酸的

3、方法，来大幅度的提高分子量，同时简化了交联技术，采用一步法合成了比对照品数均分子量高出数倍的可溶性高分子量的透明质酸，也同时合成了水不溶性的透明质酸凝胶，其流变学的粘弹性参数优于国外同类产品，同时我们独创了变联荆消除方法，可以把交联剂含量减少到I P P M 以下，具备了工业化生产的条件。崩解剂是速释片的主要成分之一，我们研究制备交联黄原胶，探索作为片剂崩解剂，应用于中药速释片提高片剂的崩解、溶出速度。本实验以D V S，甲醛等为交联剂合成交联黄原胶。制备方法为：黄原胶(2 9)加入到2 0 0 0 m l 温水(5 0度)中以2 0 0 转分钟机械搅拌，温度控制在5 0 左右，至黄原胶全部溶

4、胀。过2 0 目筛，形成O 1 的黄原胶溶液。加入i 0 0“lP V S，继续2 0 0 转分钟机械搅拌，控制反应温度3 7 反应3 小时，除去交联剂后在迸风温度1 7 0，出风温度7 0 条件下喷雾干燥。筛选四个处方，按最佳处方压片，比较交联黄原胶与其他常用崩解剂之间的崩解、溶出性能差异。P V P，c M S N a 作为对照的崩解剂。试验的结果证明喷雾干燥法形成的交联黄原胶可以有效的提高难溶性药物A5 0 m g 片剂的崩解、溶出速度。3 0 m i n 的累积溶出百分率达到8 0 以上，6 0 m i n的累积溶出百分率达到9 3 以上而对应空白片分别为5 和6，C M S-N a

5、片分别为7 0 和8 0，交联P V P 片为6 7 和8 1。其崩解、溶出性能优于常用高效崩解剂C M S-N a、交联P V P。与其他崩解剂相比具有定的防潮性能。超声通过其空化效应可增加细胞膜的通透性，进而能促使外源基因进入细胞，增强了基因在体外细胞和体内细胞的转染和表达水平。超声介导的微泡造影剂破坏可进一步增强基因的转染率，其主要机制是空化效应超声波介导的基因输送技术相对于其他物理输送技术相对安全，操作也比较简单，被认为是增强菲病毒载体基因治疗效率的新方法。我们主要研究超声波介导的体外基因输送技术。我们的目的是将超声波这一无损的技术有效地用于基因治疗。我们主要用荧光素酶(L u c i

6、 f e r a s e)作为报道基因进行超声波介导的体外基因输送，转染效果用L u m i n o m i i e r 定量测定，细胞为C 6 大鼠胶质瘤细胞。博士后出站报告我们探索了用含气型的脂质体作为空化核，通过物理、化学方法在脂质体中导入气体。实验表明用一种化学方法，选择不同的脂质配方，可以较为有效的在脂质体中导入气体，当使用D S P C 或S P C 时，制得的空泡较为有效。我们将此空泡结合超声波用于体外基因输送实验，在超声波声强为0 4 w c m 2 时，基因的转染效率提高了6 0 0 0 倍。我们希望最终能实现在外部超声波介导，同时存在微泡时，实现药物的靶向输送。关键词：透明

7、质酸，交联，分子量，崩解剂，黄原胶，超声，微泡，基因转染墼星堂堂望宣A b s tr a c tH y a l u r o n a n(h y a l u r o n i ca c i d，H A)i sa1 i n e a rp o l y s a c c h a r i d et y p i c a l l yf o u n di nt h ec o n n e c t i r et i s s u e sa n db o d yf l u i d so fv e r t e b r a t e sa sw e l la si ns o m eb a c t e r i a，c o m p

8、 o s e do fa l t e r n a t i n gr e s i d u e so fD-g l u c u r o n i ca c i da n dN-a c e t y l D g l u c o s a m i n el i n k e db yb o n d si nr e p e a t i n gu n i t s，D i s a c c h a r i d e sarel i n k e dt oe a c ho t h e rb yBb o n d s T h ep r i m a r ys t r u c t u r eo fH Ac o n t a i n

9、sn e i t h e rs u l f a t eg r o u p sn o r p e p t i d ea si ti sn o tc o v a l e n t l yb o u n dt op r o t e i n s，a n di t sm o l e c u l a rm a s si su s u a l l yi nt h er a n g eo fm i l l i o n s H Am a i n t a i n sw a t e rb a l a n c ea n di si m p o r t a n ti nc e l l u l a ri n t e r a

10、 c t i o n s a si ti n t e r a c t s w i t hav a r i e t yo fd i f f e r e n tp r o t e i n si n c l u d i n gl i n kp r o t e i n，C D 4 4。A sa na S S i m i l a b l eb i o m a t e r i a l，H y a l u r o n i cA c i dh a sf o u n dg r e a tu s e si nc i i n i c a lm e d i c i n ea n dc o s m e t i c sd

11、 e v e l o p m e n t T h er h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so fH Aa sal u b r i c a t i n ga n ds h o c ka b s o r b i n ga g e n to fh i g hm o l e c u l a rm a s sp r o v i d ef o ri t susea sa na d j u n c ti no p h t h a l m i cs u r g e r ya n di nf a c i l i t a t i n gm a n i p u l a t

12、i o no fo c u l a rt i s s u e s，a sw e l la si nt h et r e a t m e n to fp a t i e n t sw i t hr h e u m a t o i do ro s t e o a r t h r i t i sO s t e o a r t h r i t i s(O A)o rd e g e n e r a t i r ej o i n td i s e a s ei st h em o s tf r e q u e n tj o i n td i t e a s ek n o w nt om a n T h e

13、t r e a t m e n to f O Ac o n s i s t so fp a i nr e d u c t i o n，m o d i f i c a t i o no fa c t i v i t i e so fd a i l yl i v i n ga n di m p r o v e m e n to fj o i n tf u n c t i o n 2 H y a l u r o n i ca c i dc o n t r i h u t e st ot h ee l a s t i c i t ya n dv i S C O S i t yo fs y n o v

14、i a lf l u i d，a n dt h u sh y a l u r o n a n sareu s e df o r t h ev i s c os u p p l e m e n t a t i o no fj o i n t s。B u t t h ed e g r a d i n gv e l o c i t yo fH Ai nv i v oi sm u c hq u i c kt h a nw ew a n t e da n d t h er e s i d u u mo fd e g r a d a t i o nc a nb r i n gi n f l a m m a

15、 t o r yr e a c t i o n S oi tM si m p o r t a n tt h a tt h o u g hc h e m i c a lr e a c t i o nt oi n c r e a s i n gm o l e c u l a rw e i g h tf o rr e d u c e dd e g r a d a t i o na n dp r o l o n g e di t se f f i c i e n c yi nv i v o O u rr e s e a r c hc a ne n h a n c et h em o l e c u l

16、 a rw e i g h to fH y a l u r o n a nm e a s u r a b l yb yu s i n gD i v i n y l s u l p h o n ea sac r o s s l i n kr e a g e n ta n df o u n d e das i m p l yr e a c t i o nw a yt og e t t i n gt h i sh i g h 姗H y a l u r o n a n W ecang e th i g hm o l e c u l a rw e i g h tw a t e r s o l u b l

17、 eH Aa b o u t2 4t i m e st h a no r i g i n a lo ri n s o l u b l eg e lf o rb e a u t i f i c a t i o nb yo n es t e pr e a c t i o n T h ee l a s t i c i t ya n dv i S C O S i t y0 fH Aw a sb e t t e rt h a np r o d u c t so ft h es a m ek i n do v e r s e a s w ea l s o i n v e n t e dau n i q u

18、 ew a yt or e d u c et h el e v e lo fr e s i d u eb e l o w I P P M D i s i n t e g r a n ti st h em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n to fq u i c k r e l e a s et r o c h e W ep r e p a r e da n ds t u d i e do nc r o s sl i n k i n gx a n t h o g e n ea sad i s i n t e g r a n ti nq u i c k r

19、 e l e a s et r o c h eu s i n gC h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n et oi n c r e a s ei t sd i s i n t e g r a t i o na n dd i g e s t i o nc h a r a c t e r i s t i c s D V Sa n df o r m a l d e h y d ee m p l o y e da scrossl i n k i n gr e a c t a n tt op r o d u c tcross1 i n k i n

20、gx a n t h o g e n e T h ep r e p a r a t i o no ft h eC R O S Sl i n k i n gx a n t h o g e n ei-sa sf o ll o w s：a d d e d2 9x a n t h o g e n ei n t o2 0 0 0 m Lw a t e ra t5 0 a n ds t i r r e dw i t har o t a t es p e e da b o u t2 0 0r m i th a dg e n e r a t e dah o m o g e n e o u s博士后出站报告s

21、o l u t i o nb yf i i t e r i n gt h r o u g has i e v e(2 0m e s h)，t h e na d d e d1 0 0ulD V Si n t ot h er e a c t i o ns o l u t i o nr e a c t i n g3h o u r sa t3 7 w i t ha2 0 0 r ms p e e d A f t e rr e m o v eC R O S S1 i n k i n ga g e n t s，t h er e a c t i o nl i q u i di sd r i e db ys

22、p r a yd e h y d r a t i o n(t h et e m p e r a t u r eo fa i ri n l e ti s1 7 0 Ca n da i ro u t l e ti s7 0)S e l e c tt h eb e s t f r o mf o u ro p t i o n a lp r e s c r i p t i o n s，t h e np r e s s2 0-4 0t a b l e t sf o re v a l u a t i n gt h ed i s i n t e g r a t i o na n dd i g e s t i

23、o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s et h r e ed i s i n t e g r a n t si nq u i c k r e l e a s et r o c h e T h ea n t i t h e t i ct r o c h eu s i n gP V P Pa n dC M S N aa sd i s i n t e g r a n t，T h ec r o s sl i n k i n gx a n t h o g e n ep r e p a r e d b zs p r a yd e h y d r a t i

24、o nc a no b v i o u s l yi n c r e a s ed i s i n t e g r a t i o na n dd i g e s t i o ns p e e do ft a b l e t 霄i t hc o n t a i ni n s o l u b i l i t yd r u gA T h ea c c u m u l a t i v et o t a ld i g e s t i o ni n3 0 m i nn e a r8 0 a n d6 0 m i nu pt o9 3，o nc o n t r a s tt h et a b l e tn

25、 od i s i n t e g r a n tw i t ha b o u t5 i n3 0m i na n d6 i n6 0 m i n t h ea n t i t h e t i ct r o c h ei s7 0 i n3 0 m i no r8 0 i n6 0 m i nu s i n gC M S N aa sd i s i n t e g r a n ta n d6 7 i n3 0 m i no r8 1 i n6 0 m i n u s i n gP o l y v i n y l P o l y p y r r o l i d o n e(P V P P)a s

26、d i s i n t e g r a n tT h ee f f i c i e n c yo fd i s i n t e g r a t i o na n dd i g e s t i o ni se v e nb e t t e rt h a nu s u a ld i s i n t e g r a n t U l t r a s o u n dc a ni n c r e a s ec e l lp e r m e a b i l i t yb yc a v i r a t i o n，s ot h a ti tc a ni m p r o v et h ee f f i c i

27、e n c yo fg e n et r a n s f e c t i o na n dt r a n s g e n ee x p r e s s i o ni ne e l l si nv i t r oa n di nv i v o U l t r a s o u n d m e d i a t e dg e n ed e l i v e r yt e c h n i q u ei sc o n s i d e r e dr e l a t i v e l ys a f ea n de a s yt ou s ec o m p a r e dw i t ho t h e rp h y

28、s i c a lm e t h o d sf o rg e n ed e l i v e r ys oi th a sg r e a tp r o m i s ea san o v e la p p r o a c ht oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo fn o n v i r a lg e n ed e l i v e r y O u rm a i nw o r k si n c l u d e dc o n f i r m i n gt h ep a r a m e t e r so ft h eu l t r a s o u n de x

29、 p o s u r es y s t e mf o r t h eg e n et r a n s f e C t i o ne x p e r i m e n ti nv i t r o W eu s et h eC 6c e l la st h et a r g e t e dc e l la n dl u c i f e r a s ea st h er e p o r t e rg e n e T h et r a n s f e c t i o ne f f e c to ft h el u c i f e r a s ec a nb em e a s u r e db yt h

30、el u m i n o m it e r I no r d e rt oi n c r e a s et h et r a n s f e c ti o ne f f e c t，w eh a v et om a k eak i n do fa r t i f i c i a lc a v i t a t i o nn u c l e i W et r i e dt h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d st om a k eag a s f i l l e dl i p o s o m e am i c r o b u b b

31、l e O u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h r o u g ho u rc h e m i c a lm e t h o d，u s i n gt h eD S P Co rS P Ca st h es h e l lo fm i c r o b u h b l e g e n et r a n s f e c t i o nr a t ei n c r e a s e dn e a r l y6 0 0 0t i m e s O u rf u t u r eg o a li st od e l i v e rm i c r o b u

32、b b l e c a r r i e dg e n e sa n dd r u g st a r g e t e dw h e nu l t r a s o u n di su s e di nv i v o K e y w o r d：H y a l u r o n i cA c i d，c r o s s l i n k，m o l e c u l a rm 8 s s，D i s i n t e g r a n t，x a n t h o g e n e，U l t r a s o u n d，m i c r o b u b b l e，g e n ed e l i v e r y博士

33、后出站报告第一章生物可降解大分子材料一透明质酸的交联改性研究第节综述透咀质酸(H y a l u r o n i cA c i d，以下称H A)是一种独特的线性大分子粘多糖由葡萄糖醛酸和N 一乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成，依据组织来源不同，分子量变化于1 0 5 一l O7 之间，H A 广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中在眼玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高，血清中含量最低。与其它天然粘多糖不同，H A 分子内不含硫酸基因，也不与蛋白质共价结合。能以自由链形式在体内游离存在早期研究认为H A 仅是一种细胞空间填充物，未能引起人们重视，但在过去的1 0 年里，随着对H

34、 A 结构、性能、生物功能认识的深入，H A 己成为细胞生物、病理、免疫学等领域的研究热点。H A 以其高度的粘弹性，可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为一种可吸收、可降解的生物材料，已广泛应用于l 临床医学和高级化妆品生产。近年来H A 的市场需求与日俱增，表现出良好的市场潜力和广阔的应用前景。H A 的应用化妆品生产方面当含有H A 的护肤品涂在皮肤表面时，H A 能形成一层粘弹性水化膜(分子网络)，该水化膜能润湿角质层，维持和加强角质层自身的吸水能力和屏障功能，促进皮肤对护肤品中其它活性营养成分的吸收，防止皮肤干燥，使皮肤柔软光滑，延缓和防止皮肤老化。1。在国际化妆品行业中，H A 是

35、公认的最好的保湿剂和保湿因子，许多著名的化妆品生产商都在竞相开发含H A 系列的护肤品，如日本资生堂(S H I S E I D O)公司的“B H _ _ 2 4”精华素，美国R e v l o n 公司的“M O O ND R O P S”保湿剂。法国M a y b e l f i n 公司的H y d r o b e t l a 润肤露，国内的水芳、绿丹兰、自然美等品牌。临床医学方面粘连性手术H A 最初的医学应用是在眼科领域，并已公认H A 凝胶的应用是眼科显微手术中的一大里程碑。H A 作为粘连性手术器械的目的是在手术期间保护组织，并且给手术提供一个让出空间和移动组织的安全工具，在手

36、术后，当被留在手术部位时，它们变成粘连性手术植入物，保证组织表面的分开，提供一个防止手术后渗出的屏障。粘连性手术植入物的功效是以它们的粘弹性为基础的，粘连性手术植入物最重要的性能除它们的流变性能外，还有生物相容性。H A 作为粘连性手术器械主要用于白内障手术，现在H A 凝胶已被广泛用于白内障囊内外摘除术、人工晶体植入术、视网膜剥离术和角膜移植术等多种眼科手术中“。在移去白内障晶状体及进行人工晶体移植时，它能减少手术损伤：在玻璃体视网膜手术后，它也可用作玻璃体的替换物。最新交联的H A 凝胶在临床实验中被用作玻璃体的替换物，并证明了H A 凝胶能成功地实现脱落视网膜的长期持续的再附着；并且由于

37、h y l a n 流体的粘弹陛是相同浓度H A 溶液的几倍，所以在眼科学上正在探索h y l a n 流体作为更有效的粘弹性工具。关节炎治疗7 0 年代前期，粘性填充物己作为一种新的治疗形式而被应用到医学上。在各种形式的关节炎中，特别是骨关节炎中，关节软组织内细胞基质的粘弹性下降这种下降是由H A 的浓度下降和分子量下降，从而降低了关节滑液的生理性 牟士后出站报告保护，冲击吸收等功能。当使用H A 时，关节液的低粘弹性立即升高，疼痛减轻，关节的灵活性增加，并且流变性能通常能恢复到正常水平，而且外源性的H A注射在关节腔内，改善了关节腔的生物环境，促进患者自身体内合成高分子量的姒。1。粘弹性物

38、补充疗法在治疗膝关节炎中用H A 表现出一种安全的方式，但为了达到疗效通常要进行多次注射，可能是H A 制剂缺乏足够的粘弹性或在关节中代谢太快的缘故。这两种性能可以通过增加_ H A 的分子量来提高。交联的l A 被开发作为骨关节炎滑液粘弹性物补充疗法的治疗制剂，它具有更好的粘弹性以及更长的关节内滞留时间，并且通过临床实验证瞻丁它的有效性和安全性扣。1。A 已成为I l 盎床上治疗各种骨关节病的首选生物医学材料。防止粘连H A 和它的衍生物在手术后防止组织粘连中的应用已得到了广泛的重视，其应用效果在国内外的大量临床实践中得到了证明哺1。在手术期间或手术后，在手术部位组织间引入HA 凝胶、薄膜或

39、海绵来分离正愈合的组织或者防止正愈合的组织术后粘连，而不会影响伤口的愈合。在一段合适的时闯后，H A 凝胶、薄膜或海绵将扩散或降解。但必须保持在合适的位置，并在一个长时间内防止组织接触，以便当H A 凝胶、薄膜或海绵扩散或降解，组织开始接触时，不再有粘连的趋势。生物相容性的H A 凝胶、薄膜和海绵防止粘连的手术包括：在腹部区域进行的手术中，防止肠或肠系膜粘连；在涉及肌腱的手术中，在手术后的定位期间，防止肌腱和周围膜或其它周围组织间的粘连。在眼科手术中，它被用在眼前房防止角膜和虹膜间的虹膜粘连，特别是用于神经受损后的重修，而且可降解的或永久的移植片在青光眼手术或斜视手术后防止粘连效果也较满意。药

40、物缓释H A 及其衍生物已被研制作为有生物活性的分子的被控和定位的药物载体，并且具有缓释作用辟1。A 是一种具有特殊的生物相容性和独特的流变性能的天然多糖，化学改性的H A 既保留了天然H A 的生物相客性，又提供了各种释放体系的主要成份，当改性的H A 用作载体来缓释有药物活性的物质到动物机体所需部位时，有药物活性的物质被选择与改性的H A 共价结合形成一个能控制释放的药物缓释体系：另一方面，有药物活性的物质也能与改性的H A 非共价相互作用。A 及其衍生物对各种有药理活性分子的优先释放能力可在体外和体内测定。H A 缓释体系的治疗药物可以是水溶性的或非水溶性，阴离子或阳离子型，只要它们能与

41、m 上的基团形成共价键或离子键等相互作用，H A 缓释体系特别适合于控制生长因子(自细胞素、前列腺素等)、固醇类、抗生素、止痛药、麻醉药、防腐剂等多种药物。H A 缓释体系能以多种形式如静脉注射、关节内注射、皮下注射等引入体内。H A 及其衍生物载体能提供独特的生物相容性、流变性能及化学和物理多样性，是一种有药理活性分子的有效缓释体系，H A 和各种药物结合将是H A 临床应用的重点。软组织的增大一种非水溶性的、可注射的、可移植的H A 衍生物被研制用于软组织的修补和增大。由于改性的H A 的生物相容性，非致炎性和致免疫反应，其交联结构和水不溶性限制了它的扩散和迁移作用以及其流变性能，使其在泌

42、尿科学、皮肤病学及胸部增大中用作软组织增大的一种安全、有效的替代物。博士后出站报告经皮的栓塞治疗经皮的栓塞形成已有效地用于治疗血管损伤、动脉瘤及肿瘤。在此应用中，实现纤维蛋白酶的局部血管内输送是为了通过催化纤维蛋白原到纤维蛋白的聚合，引起快速、局部的血凝块的形成。初步的人体内实验证明改性的H A 凝胶栓塞形成剂能形成完整的和长期的动脉阻塞“H A 的制各方法组织提取法制各H A 的常用原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等。主要工艺过程包括提取、除杂、沉淀和分级分离，不同组织 A _ 的提取纯化过程有一定差别。鸡冠中脂肪成分少，H A 含量高，容易绞碎，H A 产量高达0 4 7“脐带脂肪含量较鸡

43、冠高，脐带H A 产量约为0 2“”眼玻璃体H A 的提取收率为0 6 4 2 4“3。”微生物发酵法1 9 3 7 年F o r r e s t“”首次发现链球菌可以产生H A，随后有大量研究”4 1。这些研究证明很多A 群和C 群链球菌荚膜中的H A 和动物组织中的H A 在化学本质上是一致的。链球菌在一定的环境条件下，能同化吸收葡萄糖或其它碳源，以代谢物形式产生I A。交联改性尽管H A 以其良好的生物相窑性和生物降解性用途广泛，特别是在生物材料领域具有广泛的开发前景，但另一方面，纯H A 易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，也限制了它用于制各对硬度、机械强度和稳定性

44、有一定要求的生物材料，需要进行化学修饰，以制成更稳定的固态材料。此外，只有对H A 进行谨慎的化学修饰才能保持其高分子量的纯H A 的惰性和非炎性反应，才能扬长避短，使H A 生物材料更广泛应用。i A 分子中羟基、N 一乙酰氨基、羧基以及还原末端是可被化学修饰的四个部位，H A 的化学结构和H A 两个最常用的共价修饰部位羟基和功能羧基如图l 所示，且目前已报道的具有临床应用价值的H A 衍生物多为对H A 羟基和羧基修饰所产生的衍生物。图1H A 的化学结构及主要化学修饰部位羟基和羧基交联的目的是使H A 分子量和分子体积显著增大，形成连续的网状结构，在水中可洛胀但不再溶解；系挂基霞是为了

45、改进卧材料的一些理化特性，如系挂一些疏水基团后，可降低H A 的聚阴离子特性或改变分子链相互问的聚集力。这两类H A衍生物的产生，使H A 在I 艋床上的应用有了一个质的飞跃。此外，目前更为引人注目的思路是将H A 的酯化物进行交联，以期得到具有H A 交联产物和酯化产物的共同博士后出站报告优点的生物材料，更有利于临床应用。H A 交联反应既可以彻底进行，使每个m 分子都共价附着于连续的聚合物网络上不再溶解：也可以进行到有限的程度，使一些H A 分子共价键合，而交联的H A仍保持水溶性，但平均分子量比H A 增大，粘弹性增强“”。通过控锭f H A 功能基团和共价键类型，现已有多种方法对H A

46、 进行交联。多数H A 交联的方法使用了双环氧化物、双碳二亚胺(b i s c a r b o d i m i d e)、酰肼(h y d r a z i d e)和二乙烯基矾(d i v i n y l s M l f o n e，D V S)等多功能试剂。前三种试剂优先与羧基作用，D V S 优先与羟基作用，而单功能醛则通过羟基基团间的蛋白质桥对H A 交联。此外，其他多糖和蛋白质也可与H A 交联，产生共聚物。“。总的来说，这些试剂可合成连续的 l A交联网状结构。第二节研究项目的提出和可行性分析一、立项依据(项目来源、实旌项目的意义等)H A 已经在医学领域得到广泛应用，包括黏弹性手术

47、、关节炎治疗、防止术后组织粘连、药物缓释以及软组织的增大(如皮肤、泌尿系统及再造术的应用)等。但是由于天然的H A 在体内易于降解，不易存留，限制了其疗效的发挥。尤其是近年来在预防粘连和软组织填充等方面的应用，要求H A 在人体内应具有适宜的存留时间，有时甚至要求在体内长期存留。然而，尽管H A 以其良好的生物相容性和生物降解性用途广泛，特别是在生物材料领域具有广泛的开发前景，但另一方面，纯H A 易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，也限制了它用于制各对硬度、机械强度和稳定性有一定要求的生物材料，同时天然透明质酸分子量低(1 0 0 万左右)，体内代谢快，同时代谢容易产生炎

48、症反应。从图3 可以看到经过D V S 交联后形成的H y l g a n 的分子量，粘度，和每周注射次数都要好于天然对照品。从图2 可知高分子量的透明质酸的粘弹性要远远好于低分子量的透明质酸，这对于关节炎患者的运动机能有着重大影响，所以作为粘弹性补充疗法的透明质酸要求分子量比较高，高分子量交联透明质酸也被称为第三代透明质酸，是采用化学方法对透明质酸进行修饰和交联的产物。由这种交联透明质酸制备的凝胶具有与关节滑液非常接近的物理化学特性，同时稳定性更好，体内的半衰期更长。例如美国G e n z y m e公司开发的治疗骨关节炎的S y n v i s c T M 产品，就是交联透明质酸的代表。为

49、了提高透明质酸的分子量最有效的方法是进行化学修饰，以制成更稳定的固态材料。此外，只有对H A 进行谨慎的化学修饰才能保持其高分子量的纯H A的惰性和非炎性反应，才能扬长避短，使H A 生物材料更广泛应用，对H A 进行交联反应，即在温和的中性条件下或碱性条件下将H A 由秸性溶胶向交联水凝胶转化，将大大提高分子量。从而得到体内存留时间延长、机械强度和稳定性显著提高的新一类不溶性H A 聚合物。天然存在的透明质酸为线性均聚糖，由N 一乙酰氨基葡糖和p-扯葡糖醛酸二糖单位反应交替联接而成。分子中具有大量的羧基、羟基和乙酰基团可以用于交联改性。但是羧基是维系透明质酸正常分子生理机能所必须的基团，如果

50、把它大量交联会影响透明质酸的生理活性和水溶性，改变它的理化特性，这是我们所不愿意看到的。所以通过D V S 连接透明质酸上的大量羟基是最好的办法，丽且D V S 交联已经被证明是百行的和安全的。博士后出站报告我们拟仿制美国G e n z y m e 公司的S y a v i s c T M 产品，对高分子量交联透明质酸产品进行开发。希望以此为基础，开发系列高附加值的透明质酸衍生产品。图2 几种用于关节疾病的H A 制剂的比较蕾日e 目q 幂羁埘曩薯率革昀默蔫H 糟a E I，I 皤矗率研靠盼4 0 0 呻。与l 矧a I 镶柱面塞葺，舟山q m 坫ft 嘶叫叶砖拈度健i 惑气，d E 目r”再