L_色氨酸生产菌质粒稳定性工艺研究.pdf

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1、发 酵 科 技 通 讯第40卷第1期2011年1月L-色氨酸(L-tryptophan)的化学名称为-氨基-吲哚基丙酸，是Hopkins和Cole在1902年发现并分离到的一种氨基酸1。L-色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用,因此被广泛用于医药、食品和饲料等领域2。近年来，随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为微生物发酵法发酵生产L-色氨酸提供了重大的技术支持，使得微生物发酵法成为大规模生产L-色氨酸的首选技术。由于大肠杆菌具有遗传特性较清楚、易培养、发酵周期短并能实现目的基因的高效表达等特性，因而重组大肠杆菌得到广泛地应用3。大肠杆菌表达系统广泛用于异源蛋白的表达,质粒稳定

2、性是影响发酵产量的重要因素,丢失质粒的空细胞的出现导致所表达蛋白的产量下降。一般情况下,质粒增加了细胞的代谢负担,与含质粒的细胞相比,丢失质粒的空细胞通常具有较高的比生长速率4-5,若空细胞出现在发酵初期,将会成为优势群体。外源基因表达后,由于代谢负担的增加,质粒稳定性迅速降低6。本文通过对不同选择压力、温度、溶氧、酵母抽提物、和葡萄糖浓度的分析，优化了大肠杆菌(E.coli TRJH)生产L-色氨酸分批补料发酵工艺，显著提高了生产菌的质粒稳定性和L-色氨酸产量。1材料与方法1.1菌种大肠杆菌TRJH(trpEDCBA+tetR)，天津科技大学工业微生物菌种保藏室提供。1.2培养基种子培养基(

3、g/l)：葡萄糖20，酵母膏15，（NH4）2SO410，柠檬酸钠0.5，MgSO47H2O 5，KH2PO41.5，FeSO47H2O 15mg，VB1100mg，四 环 素50mg，pH7.07.2，0.75105Pa灭菌15 min。发酵培养基(g/l)：葡萄糖20，酵母膏1，（NH4）2SO44，柠檬酸钠2，MgSO47H2O5，KH2PO42，FeSO47H2O100 mg，pH7.07.2，0.75105Pa灭菌15 min。1.3培养方法种子培养：吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面(32培养24h)中，将所有菌悬液接入装2.0L种子培养基5L种子罐(上海保兴)中；初始通气量1L/

4、min；搅拌转速300rmp700rmp；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度32；以泡敌消泡；待种子培养液OD6001020时，接入发酵培养基中。发酵培养：按10%接种量将种子液接入装16.2L发酵培养基的30L发酵罐(上海保兴)中；初始通气量2L/min；搅拌转速500rmp800rmp；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度32；以泡敌消泡；发酵过程中，培养基中葡萄糖浓度降至一定值时，将80%葡萄糖溶液以一定的脉冲速度流加至培养基中且维持发酵液中的葡萄糖浓度在所需浓度范围。1.4质粒缺失率的检测平板点种法：选择几个培养时间,随机挑取在L-色氨酸生产菌质粒稳定性工艺研究黄静程立坤

5、刘倩徐庆阳谢希贤陈宁（天津科技大学生物工程学院天津300457）摘要：从工程应用的角度研究L-色氨酸生产菌E.coli TRJH的质粒稳定性,采用30L自动控制发酵罐观察选择压力、温度、溶氧、酵母抽提物和葡萄糖浓度等条件对质粒稳定性的影响。结果表明，该菌具有分裂不稳定性，上述培养条件的变化均会对该菌的质粒稳定性产生较大影响。关键词：L-色氨酸发酵质粒稳定性15发 酵 科 技 通 讯第40卷非选择性培养基上生长的菌落,分别点种在对应的选择性培养基和非选择性培养基平板上,观察两种平板中菌体生长情况,计算两种平板上生长的菌数比例,验证质粒的缺失率7。1.5分析方法1.5.1菌体生物量：菌体生物量以菌

6、体干重表示，取10ml发酵液，1000rmp离心20min，将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中80干燥至恒重，用分析天平称重。1.5.2葡萄糖浓度：采用SBA-40C（山东科学院生物研究所）生物传感仪测定。1.5.3L-色氨酸浓度：L-色氨酸含量采用高效液相分析系统测定，色谱分离条件：Agilent C18(15mm4.6mm,3.5m)，流动相V(0.03%KH2PO4溶液):V(甲醇)=90:10，流速1ml/min，检测波长278nm；乙酸浓度测定采用RP-HPLC8。2结果与讨论2.1选择压力对质粒稳定性的影响在种子培养基中分别添加0、20、50、100g/ml的四环素，发酵36

7、h时，采用平板稀释计数法考察质粒的缺失情况。试验结果如图1所示。由图1可知，当种子培养基无抗生素作选择性压力时，质粒有一定程度的丢失，当四环素浓度大于50g/ml时，质粒基本不丢失。但四环素浓度过高，会抑制菌体的生长，且不利于产酸。此外由于抗生素的大量使用，会造成环境污染及提高生产成本，因此在大规模生产系统不适用。2.2温度对质粒稳定性影响微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件9。因此，各种微生物在一定的条件下都有一个最适的生长温度范围，温度过高或过低都会影响微生物的比生长速率，Seo和Bailey发现生长速率增大，质粒的拷贝数下降，认为高比生长速率下，质

8、粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率10。发酵过程分别采用不同的温度(28、30、33、36)发酵36h时，采用平板点种法考察质粒的缺失情况。试验结果如图2所示。由图2可知，36时虽然获得最高的菌体量，但是产酸却不是最高的，质粒丢失比较严重。说明温度升高使生产菌比生长速率过大从而增加了质粒分配不稳定性。28时质粒基本不丢失，但是过低的温度使菌体生长缓慢产酸下降。因此需要选择一个适当的温度(如32)使菌体生长速率与质粒稳定性之间达到平衡。2.3溶氧对质粒稳定性影响携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵液中必须有足够浓度的溶解氧，才能满足菌体生长及合成色氨酸的需要。

9、因此考察溶氧对质粒稳定性的影响。分别维持5%、10、20和40%的溶氧，发酵36 h，采用平板稀释计数法考察质粒的缺失情况。试验结果如图3所示。由图3可知，发酵过程中维持5溶氧，质粒缺失现象严重，对L-色氨酸的产生影响很大，随着溶氧的逐步提高，质粒的缺失现象也逐渐减少，当溶氧大于20时，质粒基本不丢失。2.4酵母抽提物对质粒稳定性影响酵母抽提物中含有丰富的氨基酸、肽类、水溶性维生素及糖类,研究表明酵母抽提物对大肠杆菌图1选择压力对质粒稳定性的影响图2温度对质粒稳定性的影响图3溶氧对质粒稳定性的影响16发 酵 科 技 通 讯第40卷第1期2011年1月生长具有明显的促进作用，且以促进细菌分裂为主

10、11。在发酵培养基中分别添加0、2、4、6、8、10g/l的酵母抽提物，发酵36h时，采用平板稀释计数法考察质粒的缺失情况。试验结果如图4所示。由图4可知，随着酵母抽提物添加量的增加，质粒稳定性逐渐提高，当添加量超过4g/l时质粒基本不丢失，但当添加量超过6g/l时，质粒稳定性明显下降，可能的原因是酵母抽提物的过量加入使培养基的C/N失衡，导致菌体初期生长旺盛，繁殖量大，比生长速率过大，代谢废物增多、粘度大，影响溶氧，使菌体后期生长缓慢、代谢异常，从而影响表达产物的合成12。2.5葡萄糖浓度对质粒稳定性的影响发酵过程中维持不同的葡萄糖浓度,对发酵液中乙酸浓度和带质粒菌数进行检测,结果见图5。由

11、图5可知,当葡萄糖浓度大于30 g/l时,发酵液中乙酸浓度相对较高,且带质粒菌数最少,这主要因为L-色氨酸生产菌对葡萄糖的副产物乙酸非常敏感,在乙酸存在时,不但生长受到抑制,外源基因的表达也会大大下降。L-色氨酸生产菌对糖类的摄取是通过基团转移的方式进行的。L-色氨酸生产菌对糖类的转运能力很强,而且在糖进入细胞的同时,糖酵解作用就已经开始了,使得大量的碳源涌入细胞。由于L-色氨酸生产菌的氧化磷酸化和TCA循环的能力有限,造成碳代谢流在糖酵解途径中过量,必须通过分泌部分氧化的副产物使碳代谢流得到平衡,而乙酸就是其中的主要副产物。基质中乙酸浓度过高对生物产能具有抑制作用,最终将导致细胞生长停滞。此

12、外,当乙酸的浓度超过1.0 g/l时,目的基因的表达会大幅度降低12。3结论工程菌在保存及发酵生产过程中表现出不稳定性,该问题的解决己成为基因工程的技术成果能否转变为生产力的关键因素。本文通过对不同选择压力、温度、溶氧、酵母抽提物、和葡萄糖浓度的分析，优化了大肠杆菌(E.coli TRJH)生产L-色氨酸分批补料发酵工艺，最终确定在种子培养基中加入四环素50g/ml,在发酵培养基中添加4 g/l酵母浸出物，控制温度在32，控制溶氧水平在20%40%，维持葡萄糖浓度为5g/l能显著提高生产菌的质粒稳定性和L-色氨酸产量。参考文献：1宋波.色氨酸的合成及其应用.广东化工，1989(4):11-17

13、2赵春光,程立坤,徐庆阳,等.微生物法生产L-色氨酸的研究进展.发酵科技通讯,，2008,37(4):34-36.3Hodgson J.Expression systems:a users guide.Emphasis hasshifted from the vector construct to the host organism.Biotechnolo-gy，1993，11(8):887893.4Yazdani S S,Mukherjee K J.Continuous culture studies on thestability and expression of recombinant

14、 streptokinase in Escherichiacoli:Stability and expression of streptokinase in continuous cultureJ.Bioprocess Biosyst Eng，2002，24(6):3412346.5Imanaka T,Aiba S.A perspective on the application of geneticengineering stability of recombinant plasmid J.Ann N Y Acad Sci，1981，369(2):1-14.6Tierny Y,Hounsa

15、C-G,Hornez J-P.Effect s of a recombinantgene product and growt h conditions on plasmid stability in pecti-nolytic Escherichia coli cells J.Microbios,1999，97(386):39-53.7邱晓颖,朱红惠,卢秋雁.质粒pMC73A在宿主细菌中的稳定性研究J.高技术通讯，1998，6:5254.8Suare DC,Kilikian BV.Acetic acid accumulation in aerobicgrowth of recombinant

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