计算机在生命科学中的应用第四次作业.pdf

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1、对硫矿硫化叶菌的一段未知功能蛋白的基因进行引物设计 实验目的：1.利用软件 Vector NTI Explore 对硫矿硫化叶菌 DNA 序列进行酶切找到含目的基因的比较小的片段 2.利用软件 Vector NTI Explore 进行引物设计引物 实验材料：Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）的一段 DNA 序列。实验原理：1.引物设计的原则：A 长度在 1835bp，GC 含量在 40%60%之间，内部无发卡结构，Tm 值最好接近72；B 引物之间避免形成二聚体；C 引物 3端和模板之间不应少于 12 个连续碱基相匹配；D 在模板基因内部不应有和引物对中任一

2、条引物相似的片断；有时需要在引物的 3端加上适当的酶切位点。E.引物 3端不能选择 A，最好选择 T。F.引物的 5端可以修饰，而 3端不可修饰。引物的 5 端决定着 PCR 产物的长度，引物 5 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等 实验内容：试验中用到古生菌的序列长12389bp，其中 80-709bp 是我们需要的未知功能蛋白质的基因序列，利用 Vector NTI Explorer 分析酶切位点，依次用 PStI、EcoRI和ClaI处理，在使用另一种酶处理之前，先用琼脂糖凝胶电

3、泳分离目的 DNA 片段，最后得到11429的 DNA片段，是理想的PCR模板。再次使用Vector NTI Explorer分析，设计 9 的 PCR 引物，使用 PCR 扩增得到目的 DNA。1,首先我们要用限制性内切酶将冗余的片段切去。找目的基因所在的片段 712389 bpPst I(3370)ClaI(2372)ClaI(11744)HindIII(2494)HindIII(2828)HindIII(3066)HindIII(3884)HindIII(737 3)NcoI(4042)NcoI(6593)NcoI(7 47 2)NcoI(10443)NcoI(11425)EcoRI(1

4、429)EcoRI(2696)EcoRI(3259)EcoRI(5730)EcoRI(5748)EcoRI(6201)SmaI(7 369)SmaI(7 492)SmaI(7 560)SmaI(9182)SmaI(9210)SmaI(9867)SmaI(11687)X maI(7 367)X maI(7 490)X maI(7 558)X maI(9180)X maI(9208)X maI(9865)X maI(11685)Av a I(368)Av a I(7 367)Av a I(7 490)Av a I(7 558)Av a I(7 827)Av a I(8088)Av a I(8801

5、)Av a I(9142)Av a I(9180)Av a I(9208)Av a I(9597)Av a I(9865)Av a I(11344)Av a I(11434)Av a I(11685)Av a I(12094)这是 Sulfolobus solfataricus P2（硫矿硫化叶菌）DNA 序列利用软件 Vector NTI所能找到的所有酶切位点：因为该物种中限制性内切酶 PstI 只有一个切点，且位于 3370bp 处，可以一次性出去一大段多余的部分，所以先用 PstI 酶切并进行电泳，选择琼脂糖凝胶进行电泳，结果如下图：11 300 700 2K5K10K20K100K10

6、M电泳中DNA片段越大则跑的越慢，DNA片段越小跑得越快，所以03370bp应该跑得比另一条带快，可以回收跑得最远的那条带，那段序列应该是13370bp。83370 bpAva I(368)Cla I(2372)PstI(3370)Eco RI(1429)Eco RI(2696)Eco RI(3259)Hin dIII(2494)Hin dIII(2828)Hin dIII(3066)，11 300 700 2K5K10K20K100K10M 为了一步就能得到我们 想 要 的 目 的 片 段，在13370bp处，用 EcoRI和ClaI双酶切再进行电泳，这样做的目的在于可以一步就能得到我们想要

7、的目的片段，而且电泳后的条带清晰，在实验室中好回收。而用这两种酶切产生的片段长度分别1429bp，943bp，342bp，563bp，111bp，电泳结果如图：同理，我们将 1429bp处的电泳条带中的DNA序列取出，回收里面的DNA,这就是我们需要的含有目的基因的DNA序列。这一段序列就有一个酶切位点AvaI，如图9所示。用工具找它的ORF，ORF的分析结80709bp处，91430 bpAva I(368)1 AAAATCTTCC AATTATTTCA GTAGTGTCTA TCTTTTAATA TGAAAAATTT TTGATGTTTT AGTTTGAAAA ATTTATTAAG TGA

8、GAAAACA ACTCTCTATT TTTTAGAAGG TTAATAAAGT CATCACAGAT AGAAAATTAT ACTTTTTAAA AACTACAAAA TCAAACTTTT TAAATAATTC ACTCTTTTGT TGAGAGATAA 101 GGAATGAAGA ATCTTTATAA AATTAACTTT TCAATATCAC ACCAAGGTTG CTGGACCAGC AAAATAAAAG ATAGTGTTGT TACCTTAAAT GTATCAAAAT CCTTACTTCT TAGAAATATT TTAATTGAAA AGTTATAGTG TGGTTCCAAC GA

9、CCTGGTCG TTTTATTTTC TATCACAACA ATGGAATTTA CATAGTTTTA 201 ATAATAATAA GAAAGTCAGA GTCACAATAG CTTCTCCAAA ATTAATAGTA ACTGACCTAA AAAGGTCAGA AAACGTTTAC GAAATTCTAA AGTATAGAAA TATTATTATT CTTTCAGTCT CAGTGTTATC GAAGAGGTTT TAATTATCAT TGACTGGATT TTTCCAGTCT TTTGCAAATG CTTTAAGATT TCATATCTTT AvaI 301 GGTAAAAGGG GGT

10、TATATAA TTGACTTCCT TGAAGATCTG AGTACTACAA TTTCAGGATA TATACTCTCG AGCAGTAATA TATTAGAATA TAGAAATGTC CCATTTTCCC CCAATATATT AACTGAAGGA ACTTCTAGAC TCATGATGTT AAAGTCCTAT ATATGAGAGC TCGTCATTAT ATAATCTTAT ATCTTTACAG 401 GTAAGGGAAG GAATAGAAAA GTGGGAAGTA ACAACTTTAG CCAAATCTTT AGTAGGCAAA TTATCAGAAA GATTTCCCAT AG

11、ATAGCATT GTAGTTAAAG CATTCCCTTC CTTATCTTTT CACCCTTCAT TGTTGAAATC GGTTTAGAAA TCATCCGTTT AATAGTCTTT CTAAAGGGTA TCTATCGTAA CATCAATTTC 501 AAATAAAGTT TTCAGATATG TTCTATAATG GTTTGACAGA AAAGGAGATA CTAGTCCTAA AAACCGCAAT AACTATGGGA TATTTCAATT ATCCAAGGCA TTTATTTCAA AAGTCTATAC AAGATATTAC CAAACTGTCT TTTCCTCTAT G

12、ATCAGGATT TTTGGCGTTA TTGATACCCT ATAAAGTTAA TAGGTTCCGT 601 AATAAAAGCT AAGGAAATTG CTGAAAAATT AGGTATCTCC AAGCAAGATT TCCTTTATCA TCTGCGAAAA TCAATAGAGA AAATAATTTT CTCATCAGTT TTATTTTCGA TTCCTTTAAC GACTTTTTAA TCCATAGAGG TTCGTTCTAA AGGAAATAGT AGACGCTTTT AGTTATCTCT TTTATTAAAA GAGTAGTCAA 701 ATAGAATAGT AATTCAT

13、GCA TATTAAATTA CTAAAAATTT AAGTGATTAA AAAGGTTTAA AAATAATATA AGACTCCTTT ATATTCAAAG ACTATAATCA TATCTTATCA TTAAGTACGT ATAATTTAAT GATTTTTAAA TTCACTAATT TTTCCAAATT TTTATTATAT TCTGAGGAAA TATAAGTTTC TGATATTAGT 801 CCGAACTTCT TAATTCTGTC TGGAAATCTG CTCTTTATCA CATAATATGT AATTATGTGA ATCAAAAGAA TAGCCCAAGC TGCATA

14、AACT GCTATATTTA GGCTTGAAGA ATTAAGACAG ACCTTTAGAC GAGAAATAGT GTATTATACA TTAATACACT TAGTTTTCTT ATCGGGTTCG ACGTATTTGA CGATATAAAT 901 ATGGGAAAGC TGGCGCAGGG TAAGTACCAA AATATATTAC AGCAATATAT AATAGTATTG AAATTATCGG TATCACTACG TGTTTCGCTA TGTTAGCCGT TACCCTTTCG ACCGCGTCCC ATTCATGGTT TTATATAATG TCGTTATATA TTATC

15、ATAAC TTTAATAGCC ATAGTGATGC ACAAAGCGAT ACAATCGGCA 1001 ACGCATTTTA ACCTTACGTA CAATTAACCC TAAGGCAGCA AATAAATGAC CTAAGGCGAC GTAGAATGAG CCAAATGTTA TTAAAAATAT ACTAGCCTCT TGCGTAAAAT TGGAATGCAT GTTAATTGGG ATTCCGTCGT TTATTTACTG GATTCCGCTG CATCTTACTC GGTTTACAAT AATTTTTATA TGATCGGAGA 1101 AACGGACCTA GAATGTAAC

16、C ACTTATAAGG CTAAGAGCAC CTGTAACAAT ACCAGTAAGT ATTATTGCAT TACCCGGCAC ACCGTATTTA TTAACTTTTG TTGCCTGGAT CTTACATTGG TGAATATTCC GATTCTCGTG GACATTGTTA TGGTCATTCA TAATAACGTA ATGGGCCGTG TGGCATAAAT AATTGAAAAC 1201 AAAAGACTTT AGGATATAAT ACACCATCCC TAGCCATACC GAATATCATT CTACTCCCAC TAGTAGCAAA CGCTAATGCA GAAGAGT

17、TAA ACATAAACGC TTTTCTGAAA TCCTATATTA TGTGGTAGGG ATCGGTATGG CTTATAGTAA GATGAGGGTG ATCATCGTTT GCGATTACGT CTTCTCAATT TGTATTTGCG 1301 TACAAGTATT ATTAACATAT ATACAATAGC GGGATTGAAA TACTTACTAT AAATCACTAT CATTGGGTCT GGAAGATTAG CATAATTAAA CATATTATTT ATGTTCATAA TAATTGTATA TATGTTATCG CCCTAACTTT ATGAATGATA TTTAG

18、TGATA GTAACCCAGA CCTTCTAATC GTATTAATTT GTATAATAAA 1401 ATTCCATAAA CTATCGTCTG CGCATAAGAA TAAGGTATTT GATAGCAGAC GCGTATTCTT 。2.选择所需的载体,确定合适的酶切位点。所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的 DNA 序列中无该酶切位点。PUC18:依靠 LacZ-基因的选择 重组体的筛选：含有重组 PUC18 分子的 E.coli 细胞在含氨苄青霉素和X-Gal 的琼脂糖板上只

19、需一步就可识别出来。结果：其中白色菌落的含重组体，蓝色菌落得不含重组体。3.酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5 端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。1.在 EcoRI 和 PstI 之间加上目的基因。在引物设计框中在正义链 5端加 PstI 酶切位点，在反义链加 EcoRI，根据引物设计原则修改参数，设计结果如下 pUC18 2686 bp AP r ALPHA P(BLA)P(LAC)ORI Ava I(435)Bam Eco RI(451)Hin dIII(400)Pst I(416)Sma I(437)Xma I(435)Apa LI(178)Ap

20、a LI(1121)Apa LI(2367)HI(430)PCR Analysis#1:Product of length 764(rating:171)Contains region of the molecule from 80 to 831 Tm:71.2 C TaOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 c

21、al/mol dG:-36.7 kcal/mol Antisense Primer:GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAA Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:56.4 C GC:41.7 dH:-177.6 kcal/mol dS:-459.1 cal/mol dG:-38.9 kcal/mol Tm Difference:2.7 GC Difference:4.2#2:Product of length 765(rating:171)Contains region of the molecul

22、e from 80 to 832 Tm:71.2 C TaOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 cal/mol dG:-36.7 kcal/mol Antisense Primer:GAATTC AGCAGATTTCCAGACAGA Similarity of primer without 5 attachme

23、nt:100.0%Length:24 Tm:54.2 C GC:41.7 dH:-170.2 kcal/mol dS:-441.0 cal/mol dG:-36.9 kcal/mol Tm Difference:0.6 GC Difference:4.2#3 Product of length 764(rating:171)Contains region of the molecule from 80 to 831 Tm:71.2 C TaOpt:51.0 C GC:29.7 Sense Primer:CTGCAG GTGAGAAAACAACTCTCT Similarity of primer

24、 without 5 attachment:100.0%Length:24 Tm:53.7 C GC:45.8 dH:-170.4 kcal/mol dS:-442.4 cal/mol dG:-36.7 kcal/mol Antisense Primer:GAATTC GCAGATTTCCAGACAGAAT Similarity of primer without 5 attachment:100.0%Length:25 Tm:56.8 C GC:40.0 dH:-186.2 kcal/mol dS:-483.0 cal/mol dG:-40.4 kcal/mol Tm Difference:3.1 GC Difference:5.8 4 根据引物设计原则，.选择合适的引物，进行 PCR 扩增，就得到大量目的 DNA 片段。