「现代生物技术概论复习提纲」.pdf

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1、现代生物技术概论复习提纲 第六章 蛋白质工程 1 了解蛋白质分子之间的相互作用；蛋白质的亚基可以被解离成游离亚基,在一定条件下又可以重新聚合；某些具有四级结构的蛋白质分子之间，亚基可以聚合，产生有活性的杂交分子；不少多肽和蛋白质分子,不论其是否由亚基组成,都能聚合成聚合物。2.蛋白质工程的基本任务；以蛋白质结构与功能为基础，通过化学和物理手段，对目标基因按预期设计进行修饰和改造,合成新的蛋白质;对现有的蛋白质加以定向改造、设计和构建，最终生产出比自然界存在的蛋白质更优良、更符合人类需求的功能蛋白质。3.图 6-6 蛋白质工程研究策略,利用反向生物学手段;蛋白质工程的主要研究手段:利用所谓的反向

2、生物学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合的氨基酸序列，通过计算机设计,进而模拟特定的氨基酸序列在细胞内或在体内环境中进行多肽折叠而成三维结构的全过程,并预测蛋白质的空间结构和表达出生物学功能的可能及其生物活性的高低程度。4.改变先有蛋白质结构的基本步骤；分离纯化目标蛋白质。分析目标蛋白质的一级结构;分析目标蛋白质的三维结构以及结构与功能的关系。根据蛋白质的一级结构设计引物，克隆目的基因。根据蛋白质的三维结构和结构与功能的关系以及蛋白质改造的目的设计改造方案。对目的基因进行人工定点突变。改造后的基因在宿主细胞中表达。分离纯化表达的蛋白质并分析其功能,评价是否达到设计目的。5.改变蛋白质结构

3、的核心技术包括基因的人工定点突变和蛋白质的人为进化，具体内容；（1）基因人工定点突变技术:M13 载体法:该法的原理是利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物,利用 M3 噬菌体载体系统合成突变基因。PCR 扩增法：该法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物,通过 PCR 扩增而获得定点突变的基因。PCR 定点诱变法可分为重组 PC定点诱变法和大引物诱变法两种。(）蛋白质的人为进化 易错CR 和 DNA hfling(NA 改组)单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DN片段。无引物CR，具有互补 3末端的片段互为引物，各为模板，通过不断的 P循环在不同模板上随机互补结合并进一

4、步延伸。最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物，这些重排产物的集合被称为突变文库。对突变文库进行筛选，选择改良的突变体进行下一轮 shui循环，重复多次重排和筛选，直到最终获得性状比较理想的突变体。.举两个蛋白质工程的应用实例;（1)胰蛋白酶:23 个氨基酸残基和以异亮氨酸为 N 端的单肽链。Arg117 位自溶点的缺失突变，得到缺失突变体,其结果表明该突变体的稳定性明显提高。将酶分子表面的正电荷改变成负电荷，以提高胰蛋白酶催化活性中心is的 pKa 值,在 pH 较高的条件下显示出对精氨酸具有更高的专一性。(）金属硫蛋白：富含半胱氨酸的小分子蛋白,半胱氨酸巯基可以结合大量的金属元素；金

5、属硫蛋白由和结构域组成。在烟草中转入串联的结构域基因后,提高了重金属抗性。蛋白质组学研究的三个领域;(1)蛋白质组学支撑技术平台或生物信息学研究。(）针对有关基因或转录组数据库的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组或亚蛋白质组及其蛋白质组连锁群,即组成性蛋白质组学研究。（3）以重要生命过程或人类重大疾病为对象,进行重要的生理病理体系或过程的局部蛋白质研究,即比较蛋白质组学研究。8 蛋白质组分析的基本过程（并参考课件上放的文献的步骤)样品制备（溶解、解聚等）分离(双向凝胶电泳）图像分析 蛋白质成分的分析与鉴定 蛋白质组研究中的样品制备 第七章 生物技术与农业 利用生物技术诱导植物雄性不育的方法 组

6、织培养诱导植物雄性不育 中国水稻所利用巴斯马提水稻品种进行胚根组织培养,然后将愈伤组织进行辐射，从而选育出巴斯马提雄性不育系。基因工程诱导植物雄性不育 花粉绒粘层表达arnase 基因阻断花粉正常的发育而造成败育，形成不育系;花粉绒粘层表达 bastar 基因转化植株中为恢复系形成的二系配套的油菜、烟草。反义NA 技术创造了拟南芥、玉米、油菜等植物不育系。原生质体融合创造不育系 萝卜与油菜的原生质体融合而产生的细胞杂种萝卜质油菜，在一般环境条件下表现为“雄性不育”。匈牙利国家自然科学院 Meczl 等以链霉素抗性基因作标记在烟草品种间进行原生质体融合，实现了烟草细胞质雄性不育基因的转移。2.生

7、物技术育种的一个重要应用是抗逆育种,通过了解各种抗性育种的实例(了解一个例子),掌握生物技术抗性育种的方法。159 在一定逆性环境选择压力下，采用组织培养、原生质体融合和体细胞杂交等生物技术手段，可以定向筛选具有抗逆性的个体，培育抗逆新品种。培育抗病毒作物:植物病毒是造成农作物减产的主要原因之一。利用基因工程技术将抗病毒基因转移到植物中,是一种比较理想的抗病毒方法。抗病毒基因工程通常采用的策略是:病毒外壳蛋白基因或其功能蛋白基因、病毒亚基因组序列、卫星NA、缺失干扰型序列的遗传转化；反义N技术等。烟草花叶病毒 TM外壳蛋白基因引入到烟草细胞中，转化植株的细胞中可以产生这种外壳蛋白,并对 TV

8、感染表现出一定的抗性。将MV 编码的一种蛋白质(分子质量4Da)的 DN序列导入植株时，可对高浓度的MV 产生抗性。为了赋予植株以病毒抗性,此特殊的NA 序列要比迄今利用的外壳蛋白基因更有效。.了解植物细胞工程应用的内容，掌握标题就可以。植物次级代谢产物的生产；快速无性繁殖；花药、花粉和胚的培养；原生质体的融合；细胞遗传操作；种质资源保存 4.何为生物农药，了解几种主要制剂。生物农药是“可用来防治病、虫、草等有害生物的生物体本身或源于生物,并可作为农药的各种生理活性物质”。生物农药可分为生物体农药和生物化学农药。生物农药本身具有的对人畜毒性小，只杀害虫，与环境相容性好以及病虫害相对不易产生抗性

9、等优点。苏云金芽孢杆菌（Bt):Bt 是当前国内外研究最多，应用最广泛的杀虫细菌。目前正朝着大吨位、多品种的方向发展。在苏云金杆菌几十年的开发利用过程中,人们在生物技术育种、发酵工艺改进、新剂型研制、新产品开发等方面取得了不同程度的进展。白僵菌:白僵菌是用于防治多种鳞翅目害虫的真菌制剂，目前已进入工业化生产和较大规模应用的虫生真菌有球孢白僵菌、卵孢白僵菌、金龟子绿僵菌等。昆虫病毒：昆虫病毒杀虫剂也是生物防治的重要手段之一，这类杀虫剂具有特异性强、毒力高、稳定性能好、安全无害等优点。进入 2世纪 8年代以后，这类杀虫剂的研究主要集中在昆虫病毒复合剂的研制、病毒的活体增殖、病毒的提取、基因工程病毒

10、杀虫剂的研究及昆虫病毒培养等领域，并都取得了显著的成就。动物转基因技术中,导入外源基因的主要方法。显微注射法：原核期胚胎的显微注射 病毒载体法：反转录病毒载体感染 脂质体介导法:脂质体人工膜包裹 DN 精子介导法:成熟精子携带外源NA 入卵 胚胎干细胞法:全能性干细胞携带外源基因导入胚胎.动物转基因技术的主要目标 促进动物生长,提高产量;改良品质性状，提高产品品质;增强动物抗病能力和抵抗不良环境能力,提高生产效益;研制动物生物反应器。.总结课本上转基因鱼的研究目的,如包括提高生长速度、抗冻等;在理论方面为动物发育机制和基因功能研究提供方法:转基因鱼的生产性研究集中在提高生长速度和抗逆性。提高生

11、长速度：生长激素提高鱼的生长速度,显示出转基因鱼在渔业生产和水产养殖业的潜在经济价值。扩大优质鱼种养殖范围:抗冻基因蛋白技术提高鱼类的抗寒能力,由此可以南鱼北养。开辟鱼类抗病新途径:基因鱼研究引进反义 RNA 技术。培育观赏鱼新品种:转荧光蛋白基因的转基因鱼。8.总结家禽转基因的方法,及鸡作为生物反应器的优点。P169 方法:生产转基因鸡的方法可分为蛋产出前的操作和产出后的操作两种类型。蛋产出前，在受精后第一次卵裂前取出单细胞的卵 蛋产出后，病毒载体法,胚胎干细胞法和原生殖细胞法。精子携带基因。鸡作为生物反应器具有突出的优点:第一,对鸡自身具有安全性。第二,鸡的输卵管是有效的蛋白质合成器,乱清

12、蛋白启动子可调控其下游的外源基因的表达,合成的基因产物可进行正确的修饰和加工，产物的生物活性接近天然动物个体。第三,鸡输卵管表达外源蛋白具有遗传稳定性，一旦获得可生产有价值蛋白质的动物个体，可用常规畜牧技术建立转基因鸡的家系。即作为生物反应器还具有哺乳动物所不具有的优点:产物易收集，且不易污染；鸡蛋成分简单，产物易分离；鸡饲养成本低,世代间隔短。用鸡蛋生产珍贵的药物外源蛋白，是转基因鸡生产的一个十分诱人的领域。.动物繁殖新技术包括？这些技术可作名词解释。P71 人工授精及精液的冷冻保存 人工授精就是利用合适的器械采集公畜的精液,经过品质检查、稀释或保存等适当的处理,再用器械把精液适时地输入到发

13、情母畜的生殖道内，以代替公母畜直接交配而使其受孕的方法。胚胎移植:是将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出,移植到另一头同种的生理状态相同的母畜体内,使之继续发育成为新个体。胚胎移植实际上是由产生胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代。胚胎的冷冻保存 胚胎冷冻保存技术包括胚胎的冷冻和解冻。抗冻剂种类和浓度、加入抗冻剂的速度、解冻的速度、稀释的速度和温度都关系到冷冻胚胎的成败。抗冻剂的毒性、胚胎渗透压的变化及冰晶形成是保存胚胎必须考虑的因素。体外胚胎生产 体外胚胎生产是指将原来在输卵管进行的精卵结合生成胚胎的过程人为地改在体外进行。体外生产胚胎的工艺过程包括卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎培

14、养。胚胎分割:是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚,经体内或体外培养,然后移植入受体子宫中发育,以得到同卵双生或同卵多生后代。性别控制技术 动物的性别控制是指通过人为地干预或操作，使动物按人们的愿望繁殖所需性别后代的技术。性别控制的技术主要采用两条途径,即 X 精子和 Y 精子的分离和胚胎性别鉴定。发情、排卵及分娩控制 发情和排卵控制是有效地干预家畜繁殖过程，提高繁殖力的一种手段。它包括诱发发情、同期发情和超数排卵等技术措施。10.什么是动物生物反应器,其应用前景如何。动物生物反应器:是利用转基因活体动物,高效表达某种外源蛋白的器官或组织,进行工业化生产功能蛋白质的技术。应用

15、前景:动物生物反应器的研究开发重点是动物乳腺反应器和动物血液反应器。即把人体相关基因整合到动物胚胎里,使出生的转基因动物血液中,或长大后产生的奶汁中,含有人类所需要的不同蛋白质。这是当前生物技术的尖端和前沿研究项目。乳腺生物反应器成功的关键是转基因动物乳腺能特异性表达外源蛋白质基因。组织特异性表达载体是否有效，包括外源基因在乳腺特异性表达，表达的蛋白质具有生物活性和表达的水平起决定性作用。转基因动物的血液生产人的血红蛋白可以解决血液来源问题;转基因鸡的蛋用来生产重组的免疫球蛋白。第八章 生物技术与食品 1.何为单细胞蛋白,用微生物生产CP 的优点；单细胞蛋白（CP):也叫微生物蛋白,它是用许多

16、工农业废料及石油废料人工培育的微生物菌体。而已，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质,而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。用微生物生产 S的优点：在最佳条件下，微生物能以惊人的速率生长,有些微生物的生产量每隔 0.51h 增加 1 倍。微生物比植物和动物更容易进行遗传操作;它们更适宜于大规模筛选高生长率的个体,更容易实施转基因技术。微生物有相当高的蛋白质含量，蛋白质的营养价值高。微生物能在相对小的连续发酵反应器中大量培养,占地小，不依赖气候。微生物的培养基来源很广泛，低廉,特别是利用废料,如有些微生物能利用植物的“残渣”纤维素作原料。2

17、.单细胞蛋白的生产途径。（)能源物质生产 SCP:甲烷；甲醇 细菌、酵母,广泛应用于动物饲料;乙醇、多链烷烃等。（2）工农业废弃物生产CP：稻秸、蔗渣、糖蜜、动物粪便和其他有机废物；一些工厂利用生产下脚料发酵生产酵母以获得SCP；Pkilo,具有纤维状结构的优质CP,以有机废料中的糖分为原料发酵而来。可以作为优良的饲用蛋白;利用淀粉中的水解单糖对丝状真菌进行发酵，生产人类可以食用的C。纤维素、木质素；食用菌。（)从藻类中生产P:小球藻,螺旋藻 3 举例说明食品发酵的途径;P18 白葡萄酒的酿造流程:一旦采摘开始，葡萄就应尽快送到酿酒场地。所使用的葡萄都不要被挤破;将葡萄珠分离出,除去果枝、果核

18、。然后在榨出的汁内放人酵母;为了更好地保存白葡萄的果香,在发酵前让葡萄皮浸泡在果汁中124h;压榨的过程要快速进行以防止葡萄的氧化；白葡萄酒是在不锈钢的酒罐或橡木酒桶里发酵的。为了保持新鲜的口感,应尽快装瓶，底部酒要过滤。啤酒：制麦芽;制浆（糖化)；发酵；加工和成熟。.食品检测中生物技术有哪些应用,并分别举例（注意,不是转基因食品的检测)（1)免疫学技术在视频检测中的应用：食品成分的检测，包括食品中诸如蛋白质等营养成分、香气成分及某些不期望成分的检测等；食品生产和加工过程中某些引起食品质量问题的成分的检测，如定性或定量检测腐败微生物及其酶等；食品安全性的检测，如病原微生物或微生物毒素、杀虫剂、

19、抗生素以及食品掺假物等检测。例如:沙门氏菌是肉品污染中一种典型的病原微生物,采用特殊材料制成的固相载体:聚酯布结合单克隆抗体放置层析柱底部富集;单克隆抗体结合到磁性粒子；全自动沙门氏菌 ELSA 检测系统。（2）分子生物学技术的应用:其中的R 技术，由于具有快速、特异和灵敏的特点,在坚持食品中致病微生物和追踪传染源方面已被广泛应用。该方法尤其适合于那些培养困难的细菌和抗原性复杂细菌的检测鉴定。现在发展的基因芯片技术可广泛应用于各种导致食品腐败的微生物检测。例如:沙门氏菌的 PC检测：寻找特异性序列，设计引物，仅能从沙门氏菌中得到特异性片段，而对照中无扩增产物。李斯特单核增生菌:检测目的基因是细

20、胞溶素基因(hlyA),是其呈现毒性所必需的。(3）生物传感器技术的应用:生物传感器选用选择性良好的生物材料(如酶、DNA 和抗原等)作为分子识别元件,当待测物与分子元件特异性结合后，所产生的复合物通过信号转换器变为可以输出的电信号、光信号等并予以放大输出，从而得到相应的检测结果。可以满足食品行业快速、可靠和简便的检测要求。.现代生物技术在未来食品工业上的应用。05 大力开发食品添加剂新品种；发展微生物的保健食品；螺旋藻食品;开发某些虫类高蛋白食品。第九章 生物技术与人类健康 1.疫苗的概念，三代疫苗分别是?疫苗:广义的疫苗是指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物,经过人工减

21、毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。其中，由细菌制成的称为菌苗；由病毒、立克次体、螺旋体等制成的称为疫苗。第一代疫苗：19 世纪中叶,法国科学家 Parseur 首先发明了减毒疫苗的制备技术。用病原体减毒或弱化制成疫苗,称之为第一代疫苗。特点:以减毒、弱化或灭活的病原体做疫苗。第二代疫苗(基因工程疫苗):将病原体的抗原（某种蛋白质)基因克隆在细菌或真核细胞内，利用其生产的病原体抗原作为疫苗。特点：利用病原体的某些抗原成分作为疫苗。第三代疫苗（核酸疫苗):将含有编码病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗,经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内,通过宿主细胞表达系统表达抗

22、原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。特点：用含有病原体抗原基因序列的质粒载体直接作为疫苗。2了解乙肝的基因工程疫苗,基因是表面抗原基因，表达系统为酵母或 CHO 细胞系.简单总结各种病毒的疫苗的研究现状，包括甲、乙、丙、戊肝和艾滋病毒疫苗。212 甲型肝炎病毒：国外已有甲型肝炎病毒灭活疫苗面市。我国使用的减毒疫苗也取得了很好的效果。国内基因工程空壳甲肝病毒及痘苗活病毒疫苗也显示了很好的免疫原性。乙型肝炎病毒:美国、日本采用酵母表达系统生产表面抗原而制成疫苗。以色列等国采用仓鼠细胞生产疫苗。我国可采用以上两种表达系统生产疫苗 戊型肝炎病毒:迄今为止世界上仍未有疫苗获批上市。厦门大学国家传

23、染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心科研人员经过艰苦的联合攻关，首次成功地利用大肠杆菌表达系统获得了戊型肝炎类病毒颗粒,目前正准备进入II 期临床试验。如果获得成功,该疫苗将成为继乙肝疫苗之后,世界上第二个基因工程病毒疫苗。丙型肝炎病毒:由于丙型肝炎病毒目前尚未能培养成功。而且丙肝病毒还存在着高突变率，尤其是包膜区的多变性,目前已知至少存在6种不同基因型的病毒,各型之间的异源性高达5%30,给丙肝疫苗的研究带来了重重困难。这也是为什么至今仍未见有丙肝疫苗上市的原因之一。艾滋病病毒疫苗:艾滋病疫苗的研究主要是通过克隆病毒外膜蛋白和g160及gp10基因后在不同的表达系统中表达，以获得基因工程疫苗。

24、目前该疫苗大多处于临床试验阶段,尚未大规模使用。4.分别举一例了解细菌性疾病疫苗和寄生虫疾病疫苗情况。细菌性疾病疫苗:霍乱弧菌疫苗 霍乱疫苗接种已有 100 多年的历史,传统疫苗是采用肌肉注射的灭活或减毒霍乱弧菌菌体苗。效果不佳，副作用大，已被 WH宣布不再推荐此疫苗的应用。根据霍乱弧菌的致病机理，科学家们利用基因工程技术研制了重组 B 亚单位疫苗，是已被HO 推荐应用的疫苗。我国军事医学科学院生物工程研究所经过十多年的研究研制出了国家一类新药 rBC 口服霍乱疫苗,并已上市。寄生虫病疫苗：疟原虫疫苗 目前疟原虫的基因工程疫苗有抗子孢子疫苗,如 CP 蛋白质；抗裂殖子疫苗；抗配子母细胞疫苗等。5.几个概念：ELISA，基因工程抗原,多克隆抗体，单克隆抗体。LIA:酶联免疫吸附检测技术 基因工程抗原:将抗原基因克隆在细菌或真核细胞表达系统中，由这些表达系统生产大量的抗原,即为基因工程抗原。多克隆抗体：由于一个抗原往往会有多个抗原决定簇，直接免疫动物后，从被免疫的动物的血清制备的抗体