免疫荧光实验步骤.pdf

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1、免疫荧光实验步骤 V b3 e)h:r;_ 1.直接免疫荧光法测抗原（1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。（2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.

2、4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜 玻片架 滤纸 37温箱等。（3）实验步骤 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于待检标本片上，10min 后弃去，使标本保持一定湿度。滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。立即用荧光显微镜

3、观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（+）荧光明亮；（+-+）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上，而各种对照显示为（）或（-），即可判定为阳性。（4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过 1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般 30 min已足够。染色温度多采用室温（25左右），高于 37可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型

4、脑炎病毒）可采用 0-2的低温，延长染色时间。低温染色过夜较3730 min 效果好的多。3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。标本自发荧光对照：标本加1-2 滴 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS。特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4)一般标本在高压汞灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度

5、会逐渐下降。2.间接免疫荧光法测抗体（1）基本原理 染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中 37保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM 抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。（2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制。荧光标记的抗人球蛋白抗体：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PB

6、S 进行稀释。搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜 玻片架 滤纸 37温箱等。（3）实验步骤 1)滴加 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 于已知抗原标本片，10min 后弃去，使标本片保持一定湿度。2)滴加以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37保温 30min。3)取出玻片，置于玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗 1-2 次，然后按顺序过 0.01mol/L，pH7.4的 PBS 三缸浸

7、泡，每缸 5min，不时振荡。4)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。5)将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37保温30min。6)重复操作 3。7)取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。8)荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。（4）注意事项 1)荧光染色后一般在1h 内完成观察，或于 4保存 4h，时间过长，会使荧光减弱。2)每次试验时，需设置以下三种对照：阳性对照：阳性血清+荧光标记物 阴性对照：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。