生物化学与分子生物学考研重点考题(可编辑修改word版).pdf

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1、一、名词解释 1.Domain：结构域又称 motif(模块)。在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。2.gene cloning：基因克隆也叫分子克隆，是指将一个基因片段与合适的载体 DNA 分子相连接，构成重组DNA 分子，然后将其导入受体细胞中复制扩增，获得该基因片段的大量拷贝。因此，基因克隆是指在分子水平进行的克隆或者说是基因工程中进行的克隆。3.southern blot：DNA 杂交技术是将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行

2、分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其 它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。4.RNA interference(RNAi)：RNA 干扰是一个自然存在的以双链 RNA 为中介降解具有相同序列 RNA 的机制，一些小的双链 RNA 可以高效、特异的阻断体内基因表达，促进 RNA 降解，可在细胞内发挥基因敲除的作用，这个过程称为 RNA 干预（即 RNAi）。5.open readi

3、ng fragment(ORF)：开放阅读框是基因序列的一部分，包含一段可以编码蛋白的碱基序列，不能被终止子打断。当一个新基因被识别，其 DNA 序列被解读，人们仍旧无法搞清相应的蛋白序列是什麽。这是因为在没有其它信息的前提下，DNA 序列可以按六种框架阅读和翻译（每条链三种，对应三种不同的起始密码子）。ORF 识别包括检测这六个阅读框架并决定哪一个包含以启动子和终止子为界限的 DNA 序列而其内部不包含启动子或密码子，符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。ORF 的识别是证明一个新的 DNA 序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。6.Ribozyme：核酶一词用于

4、描述具有催化活性的 RNA,即化学本质是核糖核酸(RNA),却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子,有些作用底物就是同一 RNA 分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割 RNA,有的能够切割 DNA,有些还具有 RNA 连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。7.PCR：聚合酶链式反应是以目的基因或 DNA 片段为模板，在引物介导及 Taq DNA 聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或 DNA 片段。它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或 DNA 片段。8.Promoter：启动子是 RNA 聚合酶识别、结合并开始转录

5、所必需的一段 DNA 序列。9.genetic code：DNA 编码链或 mRNA 上的核苷酸，以 3 个为一组（三联体）决定 1 个氨基酸的种类，称为三联体密码。mRNA 的三联体密码是连续排列的，因此，mRNA 的核苷酸序列可以决定蛋白质的一级结构。10.RFLP：限制性片段长度多态性标记是发展最早的 DNA 标记技术。RFLP 是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。11.plasimd：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以 外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指

6、细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA 分子。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状 DNA 分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细 菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的 DNA 分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。12.gene therapy：基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。13.motif：“基序”也翻译为“模体”，是

7、蛋白质等生物大分子中的保守序列。例如，在反式作用因子的结构中，基序一般指构成一种特征序列的基本结构，作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用，常常构成 DNA 结合区，正调控基因转录。常见的基序有螺旋/转角/螺旋（Helix-turn-helix,HTH），锌指(Zinc finger)，亮氨酸拉链(Leucine-Zipper)，螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)。14.gene diagnosis：基因诊断又称 DNA 诊断或分子诊断，是通过从患者体内提取样本用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物。目前，基因诊断检测的疾病主要有三大

8、类：感染性疾病的病原诊断、各种肿瘤的生物学特性的判断、遗传病的基因异常分析。在感染性疾病方面主要有结核病、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），甚至艾滋病等。15.molecular chaperon：分子伴侣也叫监护蛋白，是细胞中一大类蛋白质,是由不相关的蛋白质组成的一个家系，它们介导其它蛋白质的正确装配，但自己不成为最后功能结构中的组分。分子伴侣的概念有三个特点:凡具有这种功能的蛋白,都称为分子伴侣,尽管是完全不同的蛋白质;作用机理是不清楚的,故用了“介导”二字,以含糊其辞,“帮助”二字可理解为:通过催化的或非催化的方式,加速或减缓组装的过程,传递组装所需要的空间信息,也可能抑制

9、组装过程中不正确的副反应。分子伴侣一定不是最终组装完成的结构的组成部分,但不一定是一个分离的实体。如一些蛋白水解酶的前序列,以及一些核糖核蛋白体的加工前的部分,若具分子伴侣的作用,也称为分子伴侣。组装的涵意比较广,主要指:帮助新生肽的折叠、帮助新生肽成熟为活性蛋白、帮助蛋白质跨膜定位、亚基组装等。16.oncogene：癌基因则是细胞生长和增殖的加速器，它们编码的蛋白质多是生长因子或者受体，以及信号转导通路中的关键分子，能够促进细胞的生长和增殖，抑制细胞凋亡。大多数癌基因都是由与细胞生长和分裂 有关的正常基因(原癌基因)突变而来。就癌基因的来源分为两类，一类是细胞癌基因(cellular on

10、cogene，c-onc)，由细胞原癌基因突变而来；另一类是病毒癌基因(viral oncogene，v-onc)。17.tumor suppressor genes：与原癌基因编码的蛋白质促进细胞生长相反，在正常情况下存在于细胞内的另一类基因肿瘤抑制基因，其产物能抑制细胞的生长，若其功能丧失则可能促进细胞的肿瘤性转化。由此看来，肿瘤的发生可能是癌基因的激活与肿瘤抑制基因的失活共同作用的结果。目前了解最多的两种肿瘤抑制基因是 Rb 基因和 P53 基因。它们的产物都是以转录调节因子的方式控制细胞生长的核蛋白。其它肿瘤抑制基因还有神经纤维瘤病1 基因、结肠腺瘤性息肉基因、结肠癌丢失基因和 Wil

11、ms 瘤1 等。18.gene knockout：基因敲除，是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除不仅可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。二、问答题 1 试比较 DNA 和蛋白质的分子组成、分子结构及功能的不同。DNA 是由四种核苷酸组成，蛋白质是由 20 种氨基酸组成。DNA 可形成一级结构，二级结构和三级结

12、构。DNA 的一级结构即四种核苷酸的排列顺序，DNA 的二级结构是指两条多核苷酸连反向平行所生成的双螺旋结构。通常情况下，DNA 的二级结构分两大类：一类是右手螺旋，如 A-DNA 和 B-DNA，另一种是左手螺旋，即 Z-DNA。DNA 的高级结构是指 DNA 双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构，可分为正超螺旋和负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互转变。蛋白质可形成一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。其中二、三和四级结构又称空间结构（即三维结构）或高级结构。蛋白质的一级结构是氨基酸的排列顺序，蛋白质的二级结构是指多肽链中主链原子的局部空间排布即构象，不涉及侧链部分的构象。常见的

13、有 螺旋、片层、转角和无规则卷曲。超二级结构是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。目前发现的超二级结构有三种基本形式：螺旋组合（）；折叠组合（）和 螺旋 折叠组合（），其中以 组合最为常见。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或结构域的组成单位，是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次，故称超二级结构。结构域也是蛋白质构象中二级结构与三级结构之间的一个层次。在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别它与蛋白质亚基结构的区别。蛋白质的多肽链在各种二级结构的基础上再进一步盘曲或折迭

14、形成具有一定规律的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构。蛋白质三级结构的稳定主要靠次级键，包括氢键、疏水键、盐键以及范德华力等。具有二条或二条以上独立三级结构的多肽链组成的蛋白质，其多肽链间通过次级键相互组合而形成的空间结构称为蛋白质的四级结构。其中，每个具有独立三级结构的多肽链单位称为亚基。四级结构实际上是指亚基的立体排布、相互作用及接触部位的布局。DNA 的主要功能是储存和传递遗传信息，蛋白质的主要功能是体现生命活动。2 何谓操纵子，以大肠杆菌乳糖操纵子为例说明原核生物操纵子的调控机制。操纵子（operon）是指启动基因、终止基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。原核生物大多数基因表达调控是

15、通过操纵子机制实现的。操纵子通常由 2 个以上的编码序列与启动序列、操纵序列以及其他调节序列 在基因组中成簇串联组成。启动序列是 RNA 聚合酶结合并起动转录的特异 DNA 序列。多种原核基因启动序列特定区域内，通常在转录起始点上游-10 及-35 区域存在一些相似序列，称为共有序列。大肠杆菌及一些细菌启动序列的共有序列在-10 区域是 TATAAT，又称 Pribnow 盒（PribnowBox），在-35 区域为 TTGACA。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响 RNA 聚合酶与启动序列的结合及转录起始。因此，共有序列决定启动序列的转录活性大小。操纵序列是原核阻遏蛋白的结合位点。当

16、操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍 RNA 聚合酶与启动序列的结合，或使 RNA 聚合酶不能沿 DNA 向前移动，阻遏转录，介导负性调节。原核操纵子调节序列中还有一种特异 DNA 序列可结合激活蛋白，使转录激活，介导正性调节。乳糖操纵子包括调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。大肠杆菌的 lac 操纵子受到两方面的调控：一是对 RNA 聚合酶结合到启动子上去的调控（阳性）；二是对操纵基因的调控（阴性）。在含葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能利用乳糖，只有改用乳糖时才能利用乳糖的调控机理是：当在培养基中只有乳糖时由于乳糖是 lac 操纵子的诱导物，它可以结合在阻遏蛋白的变构位点上，使构象发生改变，破坏了阻

17、遏蛋白与操纵基因的亲和力，不能与操纵基因结合，于是 RNA 聚合酶结合于启动子，并顺利地通过操纵基因，进行结构基因的转录，产生大量分解乳糖的酶，这就是当大肠杆菌的培养基中只有乳糖时利用乳糖的原因。在含乳糖的培养基中加入葡萄糖时，不能利用乳糖的原因，即在 lac 操纵子的调控中，有降解物基因活化蛋白（CAP），当它特异地结合在启动子上时，能促进 RNA 聚合酶与启动子结合，促进转录（由于 CAP 的结合能促进转录，称为阳性调控方式）。但游离的 CAP 不能与启动子结合，必须在细胞内有足够的 cAMP 时，CAP 首先与 cAMP 形成复合物，此复合物才能与启动子相结合。葡萄糖的降解产物能降低细胞

18、内 cAMP 的含量，当向乳糖培养基中加入葡萄糖时，造成 cAMP 浓度降低，CAP 便不能结合在启动子上。此时即使有乳糖存在，RNA 聚合酶不能与启动子结合，虽已解除了对操纵基因的阻遏，也不能进行转录，所以仍不能利用乳糖。3 遗传信息是如何从 DNA 传递到蛋白质的？遗传信息的传递（中心法则）包括以下过程：DNA 复制、DNA 转录（逆转录、RNA 复制）、蛋白质合成。复制是指以亲代 DNA 分子为模板合成一个新的与亲代模板结构相同的子代 DNA 分子的过程。转录是指以DNA 或 RNA（某些病毒中）为模板，以 ATP、GTP、CTP 和 UTP 四种核糖核苷三磷酸（NTP）为底物，在RNA

19、 聚合酶和其它蛋白质因子的作用下，按碱基互补配对原则，从 5-3合成 RNA 的过程。遗传信息通过转录从 DNA 传递到 RNA。翻译又称蛋白质生物合成，是指在核糖体上，将 mRNA 所含的遗传密码转译为多肽链中相应氨基酸的过程。4 真核生物基因表达调控方式有哪些?常见的顺式作用元件有哪些？是如何调节基因表达调控的？真核生物中基因表达的调节其特点是：多层次；无操纵子和衰减子；个体发育复杂；受环境影响较小。短期调节（short-term regulation）对环境条件的改变或者细胞的及组织的生理条件的改变作出反应。长期调节(long-term regulation)是受到内在程序化的控制，受外

20、界环境的变化的影响不大。基因的活性是指具有表达的基本条件。基因的表达是指具备表达的充分条件。真核生物的基因表达调控以正性调控为主，真核启动子对 RNA 聚合酶亲和力低,需要多种激活蛋白的协同作用.转录调控蛋白有激活,阻遏或二者兼有,但以激活为主。适应环境的瞬时调空是可逆的,而发育控制调控是不可逆的,决定细胞生长,分化,发育的全过程。真核基因表达调控的环节主要有：DNA 水平:包括基因数量,结构的改变；转录水平:包括顺式作用元件与反式作用因子的作用；转录后水平:mRNA 的加工成熟以及 RNA 编辑等；翻译水平:起始复合物及 mRNA 稳定性；翻译后水平:蛋白质加工修饰；染色体水平的调控，包括染

21、色体上的基因扩增，丢失和重排。组蛋白的乙酰化和去乙酰化控制染色质活性。DNA 的甲基化和去甲基化可调控基因的活性。转录起始复合物的形成是转录的可调控环节。RNA 聚合酶(RNA pol)与启动子的结合是形成转录起始复合物的关键环节。真核生物基因表达能在 RNA 加工这一水平上进行调控。这种类型的调节可以通过选择不同 5起始点，3加尾位点以及不同内含子剪切，产生不同的成熟 mRNA，最终合成不同的蛋白。mRNA 从细胞核到细胞质的转运 也是一个重要的控制点，剪接体滞留模型就反应了这一调节的特点。基因的表达还可以通过翻译控制和 mRNA 的降解来进行调节。在分子遗传学领域，相对同一染色体或 DNA

22、 分子而言为“顺式”（cis）；对不同染色体或 DNA 分子而言为“反式”（trans）。顺式作用元件是同一 DNA 分子中具有转录调节功能的特异 DNA 序列。按功能特性，真核基因顺式作用元件分为启动子、增强子及沉默子。启动子是原核操纵子中启动序列的同义语。真核基因启动子是 RNA 聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，每一组件含 720 bp 的 DNA 序列。启动子包括至少一个转录起始点以及一个以上的机能组件。通过与RNA 聚合酶以及转录因子相互作用而调控基因表达，通常是促进基因表达。增强子就是远离转录起始点（1 30 kb）、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动子转录活性的 DNA

23、 序列，其发挥作用的方式通常与方向、距离无关。增强子通过与转录因子形成特殊的复合物，使 DNA 形成有利于转录的空间结构，增强子通常可以成千上万倍促进基因基因的表达。沉默子是某些基因含有的一种负性调节元件，当其结合特异蛋白因子时，对基因转录起阻遏作用。基因转录到沉默子的位置时，会形成一定的发夹结构，阻止转录酶的工作，从而抑制转录。5 如何使一个真核生物基因在原核生物中高效、分泌表达？原核表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因 的结构与原核生物基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考

24、虑以下基本原则：优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定mRNA 翻译的 SD 序列进行优化。具体方法包括：组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中 68 个碱基与核糖体 16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构；在克隆基因的末端，加上一个转录终止区，减轻细胞代谢负荷，减少通读机会；加入 par 区防止质粒丢失，并对无质粒细胞进行反选择，使质

25、粒拷贝数稳定在一个脚适宜的水平。提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。原核生物基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。提高外源基因 mRNA 的稳定性。原核生物的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA 或 RNA 并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA 的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。提高

26、外源基因表达产物的稳定性。原核生物中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包 括：将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋 白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子；采用突变菌株，保护表达蛋白不被降解；加入分泌信号，表达分泌蛋白。优化发酵过程。由于细菌在 100L 以上的发酵罐中的生长代谢活动与实验室条件下 200mL 摇瓶中的生长代谢活动存在很大差异，在进行工业化生产时，工程菌株大规模培养的优化设计

27、和控制对外源基因的高效表达至关重要。优化发酵过程既包括工艺方面的因素也包括生物学方面的因素。工艺方面的因素如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。生物学方面的因素包括多方面，首先是与细菌生长密切相关的条件或因素，如发酵系统中的溶氧、pH 值、温度和培养基的成分等，这些条件的改变都会影响细菌的生长及基因表达产物的稳定性。生物因素的第二方面是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产

28、物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。6 怎样从 DNA 和 RNA 定量及定性分析基因及基因表达？如果限定在 DNA 和 RNA 水平的话，分子杂交和 PCR 技术可以定性分析。DNA 测序可以定量分析。基 因表达可以用 Northern 杂交分析。常规的基因表达分析方法，如：Northern，Slot，Dot 杂交，RT-PCR，核糖核酸酶保护实验等，一次只能分析少数几个基因。而最近几年发展起来的方法(如：差减杂交，差异显示，表达序列

29、标签，基因表达序列分析，cDNA 微阵列等)，可以同时在两个或多个实验样品之间对所有的差异表达的基因进行分析。在基因表达分析方面的一个重大突破是 1977 年发明的 Northern 杂交技术。利用该技术,标记的 cDNA 或 RNA 探针与 RNA 印迹杂交来进行 mRNA 转录本表达类型的研究。即使 20 年后的今天,Northern 杂交技术仍未失去它在分子生物学方面的重要性,不管先前使用的技术如何,在转录方面检测到的差异总是被 Northern 杂交分析来证实。另一方面,RNA 酶保护测定可以检测特异的 RNAs 的表达。作为第三种方法,差异噬斑-滤膜杂交可以确定在 cDNAs 克隆方

30、面的特异之处。利用该技术的首次实验之一导致了半乳糖诱导的酵母基因的确认和分离。从那以后,该法已经使从不同器官中分离出来的无数的新基因得以分离和克隆。尽管以上技术均为研究基因表达差异的极好工具,这些方法的限制性因素是只能分析已知基因的表达类型。随着消减 cDNA 库的发展,基因表达类型的分析有了明显发展。消减 cDNA 文库是通过使一个器官的 mRNA 与另一个不同器官的 mRNA 杂交而产生。在杂交步骤中无互补条带的转录本就会被用于 cDNA 库的构建。差减杂交分析，始于 20 世纪 80 年代初，用于构建 cDNA 文库和制备差异表达探针。差异表达基因的分离是通过一个样品(tester)的

31、cDNA 与另一个样品(driver)的过量的 mRNA 杂交来实现的。在 tester 和 driver 中都表达了转录本形成的 mRNAcDNA 杂交分子，而仅在 tester 中表达的基因则以 cDNA 单链分子形式存在。双链和单链分子通过羟基磷灰石层析分开。水相中的单链 cDNA 分子则代表了仅在 tester 中表达的基因。差异表达的 cDNA 可用以构建差减文库，或者直接标记用作探针，进行文库筛选。差异显示技术是 1992 年发展起来的，该技术的基础是基于两个或多个 mRNA 样品的任意基因片段的 PCR 扩增。该技术首先用锚定引物将 mRNA 反转录成 cDNA。一般的锚定引物由

32、 polyT 加上 l2 个碱基组成(如：T12AC)。然后，反转录出的 cDNA 片段用多个 PCR 引物对其进行扩增。一般，正向引物为 10 个碱基的随机引物，反向引物为锚定引物。据估计用 240 个引物对组合(即 20 个随机引物，l2 个锚定引物)，就能覆盖所有转录本。通过比较聚丙烯酰胺凝胶电泳图，不同样品在同一位置上条带的有无以及条带的强弱来确定基因表达的差异性。最后，测定差异表达基因的序列，验证差异表达基因的真伪。随着 DNA 高通量测序技术的发展，在上个世纪 9O 年代，提出了 EST(Expressed sequence tags,ESTs，表达序列标签)文库的概念。从 cDN

33、A 文库中随机挑选克隆，进行单向测序，产生 300500bp 大小的基因片段，即为 EST 序列。基因表达的差异分析，可以通过计算某一基因片段在 EST 文库中出现频率的多少来确定 基因表达序列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)SAGE 是一个非常有效的分析基因表达的方法。SAGE 技术，即在一个基因转录本内部特定位置上，一个短的序列标签，就足以代表一个基因。SAGE 标签来自 mRNA 转录本内部限定位置的短片段。一般地说，一个 SAGE 标签包含 cDNA 末端最后一个内切酶酶切位点下游的 9 个碱基。多个 SAGE 标签联结在一起，连到

34、克隆载体上，测序。一个测序反应一般测300500 个碱基，理论上可以产生 2030 个 sAGE 标签。因为每个 SAGE 标签理论上代表一个转录本。基因表达差异可以通过比较特定 SAGE 标签在不同文库间表达丰度的差异来表示。SAGE 所代表的基因或 EST 序列可以通过与 Genbank 中的基因或 EST 序列的比较来确定。微阵列杂交(Microarray Hybridization,MH)。用微阵列技术评价基因表达开始于 1995 年。微阵列技术是在基因组尺度上分析基因的表达变化。微阵列杂交的主要步骤包括：DNA 微阵列加工，实验设计，探针制备和杂交，数据采集，数据分析，数据和信息管理

35、，数据验证等。标记的 cDNAs 或寡核苷酸与携带 DNA 或寡聚体的列阵杂交以检测基因表达的差异。当使用不同的荧光基团来标记 cDNAs 或寡核苷酸时,两个探针能被同时应用 于列阵以及在不同波长下进行比较。10000 或更多的基因表达能够在一块芯片上进行分析。这种方法的优点是用平行方式来分析表达类型的能力以及杂交结果的迅速解释。也就是说,只有当它与前面的状况进行比较分析时,这些信息才会有用。然而,应当强调的是,对于这项技术而言,基因表达应该总是在动态范围测量。分析较弱的或丰度表达的基因时,依赖于 cDNA 和寡核苷酸列阵两者的敏感性,杂交信号的强度会离开线性的范畴,从而,需要个人最优化的步骤

36、以确保差异表达基因的精确测量。7 举例说明蛋白质与疾病的关系？蛋白质（protein）是生命的物质基础，蛋白质的功能是构成机体细胞和组织，促进生长发育，参加机体物质代谢，形成抗体，增强免疫能力和供给热能，因此，没有蛋白质就没有生命。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的 16.3%。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由 20 多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。被食入的蛋白质在体内经过消化分解成氨基酸，吸收后在体内主要用于重新按一定比例组合成人体蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。因此，食物蛋白质的质

37、和量、各种氨基酸的比例，关系到人体蛋白质合成的量，尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿，都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系。每克蛋白质可提供 1675 焦耳的热能。a.镰刀状细胞贫血症是一种蛋白质分子疾病，其发病原因就是由于血红蛋白 链第六位的氨基酸残基由谷氨酸变成了缬氨酸，这一改变导致了血红蛋白三维结构的改变，从而使血红蛋白的携氧能力下降，并且变得易于凝集，从而使患者患上贫血症。b.白化病为一种常染色体隐性遗传性皮肤病，患者毛发、眼及皮肤无色素或色素缺乏。发病机理是酪氨酸酶不能合成或酪氨酸酶转输受阻使黑素不能形成所致。酪氨酸酶是一种重要的起催化作用的蛋白质，是黑素合成的

38、关键酶。c.胰岛素也是一种重要的蛋白质，可以调节人体血液中的血糖浓度，如果人体不能合成胰岛素或者合成量不足，那么人体血浆中的血糖浓度就会升高，从而导致糖尿病的发生。d.胶原纤维也是一种重要的蛋白质，参与构成细胞外基质，对细胞的正常生命的维持和细胞增殖等都具有重要作用，如果编码胶原的基因发生突变，不能合成正常的胶原纤维，或者胶原纤维装配错误，皮肤和其他各种结缔组织就会因此降低强度，导致皮肤松弛症的发生。8 基因的获得有几种方法？PCR 的原理是什么？.直接获取法。对于基因组比较小的物种，比如说病毒，通常基因组大小在几个 KB 到几十个 KB 之间，它的获得又有这么几种情况：首先，很小的，比如说猪

39、的圆环病毒，它的基因组只有几个 kb，我们可以通过基因组序列的全克隆而获得；对于基因组比较大的病毒呢，我们可以通过已知的 EST 序列或者是 DNA 序列。.从细胞基因组中直接分离：现在直接从细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是鸟枪法，又称散弹枪法。这种方法犹如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的 DNA 切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的 DNA(外源 DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方

40、法把带有目的基因的 DNA 片段分离出来。如许多抗虫、抗病毒的基因都可以用上述方法获得。.反向转录法：这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因，它以目的基因的 mRNA 为模板，借助反转录酶合成碱基互补的 DNA 片段，即 cDNA，再在 DNA 聚合酶的催化下合成双链 cDNA，亦即目的基因的双链 DNA。.人工合成：依照某一蛋白质的氨基酸序列，即可按密码子推算出其基因的核苷酸序列，随后应用化学合成法，就可在短时间内合成目的基因。.核酸杂交法。核酸杂交法是从基因文库中筛选已知序列基因的最常用、最可靠的方法，它可以同时迅速地分析数目巨大的克隆，可在严格的条件下使用，从而最大限度地较少非特

41、异性交叉反应的发生。.PCR 筛选法。该方法的基本策略是将基因文库分装 96 孔培养板，经液体培养一段时间后，分别从各孔中吸取少量培养物，并将同一行或列孔中的培养物合并，以此混合物为模板进行 PCR 扩增，最后根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。对含有阳性克隆的行或列孔中的培养物再次分装培养板，并经培养后进行第二轮 PCR。如此反复操作，直至获得阳性克隆或将其范围缩减至最小。.表达文库的免疫学筛选。对于用表达质粒或噬菌体（如 gt11）构建的 cDNA 文库，可以用表达产物的特异抗体为探针进行目的基因的筛选。.染色体步移法。其基本策略是从第一个重组克隆插入片段的一端分离出

42、一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移。反复进行基因文库的筛选，直至满足需要为止。.杂交捕捉和释放。用混合的 cDNA 与 mRNA 进行杂交，然后将 mRNA 进行体外翻译，。当某些产物的翻译由于杂合分子的形成而受到抑制时，成为杂交捕捉翻译。在此基础上，通过对混合 cDNA 再次分组并反复进行杂交捕捉翻译，最终可以鉴定出抑制某一特定蛋白翻译的单个 cDNA 克隆。.限制性标记 cDNA 扫描。其主要原

43、理是用限制性内切酶处理 cDNA,对酶切片段进行放射性标记，然后用高分辨率双向电泳对标记片段进行分离，同时定量地显示不同的 cDNA，从而展示表达基因的差异，并进一步克隆差异基因。9 RNAi 的机制及操作基本程序是怎样的？RNAi 的机制可能是细胞内双链 RNA 在 Dicer 酶的作用下，可形成-22 bp 大小的小干扰 RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs 可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与 siRNAs 序列相同的 mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.R

44、NAi 的基本操作程序：靶 siRNA 序列选择。靶 siRNAA 序列选择是 RNAi 实验成败的关键。哺乳动物细胞 RNAi 实验中，使用最广泛且最有效的是 21bp siRNA。siRNA 由正义链和反义链组成，两条链 3端均有 2 个碱基突出，一般为UU 或 dTdT，其中正义链的前 19nt 与靶基因序列相同。siRNA 设计的原则。SiRNA 双链设计时，一般在靶 mRNA 起始密码下游 100200bp 至翻译终止密码上游 d0100bp 的范围内搜寻 AA 序列，并记录每个 AA3端相邻 19 个核苷酸作为候选 si.RNA 靶位点。其中AA（N19）TT 是最理想的序列，若靶

45、 mRNA 中无此序列，亦可选用 NA（N21）或 NAR（N17）YNN（R 表示嘌呤，Y 表示嘧啶），但在合成时，siRNA 的正义链 3端需用 dTdT 代替。TuscRl 等建议设计的 siRNA不要针对 mRNA 的 5和 3端非编码区，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP（siRNA protein complex，核酸内切酶复合物）结合 mRNA，从而影响siRNA 干扰的效果。最后还应将候选 siRNA 序列在 GenBank 进行 BLAST 检索，与非同源基因具有 3 个或 3 个以上碱基相异的序列方可选用。阴性

46、对照 一个完整的 siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的 siRNA 应该和选中的 siRNA 序列有相同的组成，但是和 mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的 siRNA 序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。siRNA 的制备 目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断 dsRNAs 经 RNase III 类降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase III)体外制备 siRNA，以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体，PCR 制备的 siRNA 表达框在细胞中表达产生 siRNA。siRNA 表达载体。多数的 siR

47、NA 表达载体依赖三种 RNA 聚合酶 III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。siRNA 表达载体的优点在于可以进行较长期研究带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于 siRNA 表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。最适用于：已知一个有效的 siRNA 序列，需要维持较长

48、时间的基因沉默。不适用于：筛选 siRNA 序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。siRNA 表达框架。siRNA 表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由 PCR 得到的 siRNA 表达模版，包括一个 RNA pol III 启动子，一段发夹结构 siRNA，一个 RNA pol III 终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和 siRNA 表达载体不同的是，SECs 不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由 PCR 得到，不用一天的时间。因此，SECs 成为筛选 siRNA 的最有效工具，甚至可

49、以用来筛选在特定的研究体系中启动子和 siRNA 的最适搭配。如果在 PCR 两端添加酶切位点，那么通过 SECs 筛选出的最有效的 siRNA 后，可以直接克隆到载体中构建 siRNA 表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA 和长效抑制的研究。最适用于：筛选 siRNA 序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）siRNA 的转染。siRNA、siRNA 表达载体或 SECs 导入哺乳动物细胞中是诱导 RNAI 发生的关键。有许多转染试剂可供选用，最常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细

50、胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系，使用同一种转染试剂或方法，效果亦会不同。因此在实验过程中，有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度，转染的时间和 siRNA 与转染试剂的比例来评价。实验对照设置。实验对照是衡量 RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的 siRNA 转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的 SIRNA 浓度。有实验表明 RISC 复合物具有饱和性，且过多 siRNA 会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc,acion 等