锰超氧化物歧化酶.docx

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1、 锰超氧化物歧化酶 摘要：目的探讨重组人锰超氧化物歧化酶（rhMnSOD）的纯化条件。方法超声法破裂细胞，用热变性方法沉淀蛋白质；优化DEAE离子交换层析的的分别条件，并用葡聚糖凝胶G100分子筛分别纯化蛋白质。结果菌体破裂最佳超声功率为300W，超声70个循环，粗酶液热处理最佳温度为75 ，时间10 min；DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0，洗脱液NaCl含量为0.1 mol/L ， G100纯化后，rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg，纯化倍数是粗酶液的5倍。结论得到了适于分别纯化rhMn-SOD的较简便的工艺。 关键词：重组人锰超氧化物歧化酶；大肠杆菌；离子交换层析

2、中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0001-05 Study on Purification Condition of Recombinant Human Manganese Superoxide Dismutase CHENG Yi1,CHEN Che-sheng2, WU Qian-yi2, ZHAO Jian1*,YUAN Qin-sheng1 (1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science & Technology, S

3、hanghai 200237, China; 2. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China) Abstract：Objective To study the purification method of recombinant human manganese superoxide dismutase(rhMn-SOD). Methods The cells were fragmented by ultrasonic. The protein was

4、 precipitated by the thermal denaturation. The condition of proteins separation by DEAE ion exchange chromatography was optimized, then Sephadex G-100 molecular sieving was used to purify protein. Results The optimization condition of ultrasonic power was 300 W, the cycles of ultrasonic were 70 cycl

5、es, the best thermal denaturation was 75 and time was 10 minutes. The optimal pH value of loading buffer solution of DEAE was 9.0, the elution buffer was 0.1mol/LNaCl. After G-100, the specific activity of rhMn-SOD was 4 411.706 U/mg and it was 5-fold higher than crude enzyme extract. Conclusion The

6、 convenient method of separation and purification of rhMn-SOD is obtained. Key words：recombinant human manganese superoxide dismutase; Escherichia coli; ion exchange chromatography 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一类广泛存在于生物界的金属酶类1，是生物体防卫活性氧（ROS）毒害的关键性防线，能催化超氧阴离子（O2.-）发生歧化反应，从而清除O2.-。具有抗苍老、防辐射及治疗炎症等

7、一系列功能，已被广泛应用于食品及医疗保健行业2。真核细胞内的SOD主要有Cu，Zn，SOD和Mn-SOD 等。Mn-SOD存在于线粒体中，近年探讨发觉，Mn-SOD与炎症、苍老及肿瘤等多种疾病有关3，4。传统的Mn-SOD纯化方法较繁琐且费时费劲，不利于规模化生产5。本课题组前期已经构建表达质粒pET-Mn-SOD并转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组菌6，在摇瓶中进行了IPTG诱导表达条件的探讨7及不同诱导剂的比较探讨8，系统探讨了乳糖诱导高效表达Mn-SOD的发酵培育条件。本试验在此基础上，利用rhMn-SOD对热稳定的性质，用热变性法替代传统的硫酸铵分级沉淀蛋白质，并通过DEAE离子交

8、换层析和葡聚糖凝胶G100分子筛进一步纯化分别，探讨了重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）的纯化条件，建立了简便快捷且有利于规模化生产rhMn-SOD的方法。 1材料与方法 1.1菌株 含rhMn-SOD表达质粒的基因工程菌株，由本室施惠娟等构建并保存。 1.2试剂 DEAE-Sepharose Fast Flow（法玛西亚公司）；葡聚糖凝胶G-100（Whatman公司）；牛血清白蛋白，硫酸卡那霉素（上海源聚生物科技有限公司）；连苯三酚（E. Merk）；丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺（Fluka公司）；考马斯亮蓝G250，R250（Fluka公司）；其余为国产分析纯试剂。 1.3仪器 Mo

9、del J2-21M型高速冷冻离心机（Beckman公司）；JY 92-超声波细粉破裂机（宁波新芝科器探讨所）；HYG-回转式恒温调速摇瓶培育柜（上海新蕊自动化设备有限公司）；JM-250电泳仪（大连捷迈科建有限公司）； UV-2100紫外分光光度计（UNICO）。 1.4方法 1.4.1粗酶液的制备接种可表达rhMn-SOD的基因工程菌E.coli BL21（DE3）（含有pET24a(+)质粒）单菌落于含50g/mL 卡那霉素的LB培育液，37 振荡培育12 h后，按1接种量将活化菌转移入LB培育基中（含50g/mL 卡那霉素），37 ，200 r/min摇床培育12 h，作为种子液。以5

10、%的接种量接入种子液，37 ，200 r/min摇床进行二级培育。至A600约为2.2时用终浓度为0.25%的乳糖和2 mmol/L MnCl2诱导表达，诱导后6 h终止培育。离心收集菌体，称重。按1:10的比例将菌体悬浮于pH 9.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，冰浴中用超声波细胞粉碎机破裂细胞，超声功率为300 W，每次工作5 s，间隔5 s，循环70次。超声液在4 下12 000 r/min离心15 min，获得的上清即为粗酶液。 1.4.2粗酶液的热变性处理将 rhMn-SOD粗酶液置于75 水浴中，热变性10 min，4 下12 000 r/min离心15 min

11、，弃沉淀，取上清液。 1.4.3DEAE离子交换层析纯化 rhMn-SOD依法将DEAE离子交换凝胶预处理，然后自然沉降法装柱，用pH 9.0 的 0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液进行柱平衡，以热处理后粗酶液胶体积比为1:1上样，上样流速为1 h半个柱体积（26 mm300 mm，内装胶体积约75 mL）。上样结束后，以上样缓冲液冲洗DEAE柱，直至检测无蛋白质流出。以pH 9.0含 0.1 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，紫外检测收集并检测活性，将有活性部分合并。 1.4.4G-100分子筛纯化rhMn-SOD将保存于20%乙醇中的葡聚糖凝

12、胶G-100进行预处理后，自然沉降法灌注，柱床体积为1 cm50 cm。用pH 8.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液平衡，将DEAE纯化后活性部分上样，紫外检测收集并检测活性，将有活性部分合并。 1.4.5SOD活性测定用连苯三酚法8。 1.4.6蛋白质含量测定参照Bradford检测法9。 1.4.7聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶不连续垂直板电泳，浓缩胶浓度5%，分别胶浓度13.5%9。 2结果与探讨 2.1超声破裂条件的确定 称取1 g菌体，用pH 9.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液10 mL重新悬浮，超声5 s，间隔5 s 为1

13、个循环，分别采纳250，300，350， 400 W的功率，超声40，50，60，70个循环，测定超声后的酶活性，试验重复3次。超声均在冰浴中进行，结果见表1。 结果表明，功率为400 W时，有时菌液会有气泡产生，这不利于菌体的匀称破裂，可能导致酶蛋白变性。功率为300 W时，超声后酶活性较高且比较稳定（s值小）。因此，我们选择功率300 W，超声70个循环作为工程菌破裂的条件。 2.2粗酶液耐热性的探讨 将粗酶液分别在60，65，70，75，80 水浴中保温5，10，15，20 min，然后马上浸入水中冷却，12 000 r/min离心10 min，取上清酶液，测酶活性，结果见图1、图2。

14、图 1粗酶液的酶活性与热处理时间 图 2粗酶液的比活与热处理时间 从比活来看，75 保温10 min的效果最佳，此时酶活性也没有明显降低，因此，将75 条件下保温 10 min作为热处理法从酶液中提取rhMn-SOD的最佳条件。 2.3DEAE离子交换层析纯化rhMn-SOD条件的探讨 2.3.1DEAE离子交换层析上样缓冲液最适pH值确定将湿重为0.1 g的菌体加入10 mL pH值分别为7.5，7.8，8.0，8.5，9.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液，超声破裂细胞后离心，75 条件下，保温10 min，离心，取1 mL上清，加入1 mL DEAE胶，振荡吸附0.5 h，

15、测上清液活性，并比较吸附前后酶活性差异，结果见图3、图4。 图3pH值对吸附前后上清液中总酶量差值的影响 图4pH值对吸附后上清液中rhMn-SOD比活的影响 缓冲液pH值为9.0时，DEAE对rhMn-SOD的吸附量最大。吸附后上清液rhMn-SOD含量最少，比活最低。表明pH值为9.0时DEAE对hMn-SOD的吸附量最大。 2.3.2DEAE离子交换层析上样缓冲液最适离子浓度的确定配制pH 9.0，NaCl浓度分别为0，0.05，0.1，0.15，0.2 mol/L的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液，将菌体以1:10的比例分别加入缓冲液中，经过超声破裂细胞等处理后，离心，取上

16、清液1 mL加入到1 mL DEAE中，振荡吸附1 h，取上清液电泳鉴定，并测定蛋白质浓度。结果见图5、图6。 图5吸附后上清液蛋白质电泳鉴定 图6吸附后上清液中rhMnSOD的比活改变 pH 9.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中NaCl的浓度大于0.05 mol/L时，未吸附的蛋白质量明显增加，表明NaCl浓度大于0.05 mol/L时 DEAE的吸附实力下降。由图5、图6可见，NaCl浓度为0时，DEAE吸附酶的实力稍强于NaCl浓度为0.05 mol/L时。 2.3.3DEAE最适吸附酶量的确定将菌体与缓冲液按1:10（g:mL）的比例加入pH 9.0 的0.02 m

17、ol/L Tris-HCl缓冲液，经超声破裂等处理后离心，取上清0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL分别加入1 mL DEAE中，并用缓冲液补足体积，振荡吸附1 h，取上清液，测定酶活性及蛋白质浓度。结果见图7。 图 7上清液中总酶活性及蛋白质吸附前后的差值变更 由图7可见，当1 mL DEAE中加入粗酶液体积大于1 mL时，胶中吸附的rhMn-SOD的总酶活及蛋白质量趋于饱和。确定粗酶液与DEAE上样体积比为1:1。 2.3.4洗脱条件的确定将菌体以1:10（g:mL）的比例加入pH 9.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，经超声破裂等处理后离心，取上清液1

18、mL加入1 mL DEAE胶中，振荡吸附1 h 。低速离心，倾去未吸附的上清液，再在DEAE胶中加入上样缓冲液，洗23次，确保未吸附的上清液洗脱完全。再加入含NaCl分别为0.05，0.1，0.15，0.2，0.3，0.5mol/L的 pH 9.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液，振荡洗脱0.5 h后，取上清液。通过SDS-PAGE电泳鉴定，并测定其比活，结果见图8图9。 图 8洗脱液中蛋白质电泳鉴定 图9洗脱液中hMn-SOD比活性的改变 由图9可见，含0.05 mol/LNaCl的洗脱液不能将rhMn-SOD完全洗脱，随着NaCl浓度增加rhMn-SOD量有所增加。rhMn

19、-SOD的比活性随着NaCl浓度增加而削减，这是因强NaCl浓度将杂蛋白一同洗脱了。表明洗脱液中含NaCl 0.1mol/L时为最佳洗脱条件。 2.3.5DEAE离子交换柱层析纯化rhMn-SOD依据已确定的DEAE离子交换层析纯化条件进行上样及洗脱，紫外检测，分步收集活性部分合并，结果见图10。 图10 DEAE离子交换层析纯化rhMn-SOD的结果 2.4G-100分子筛分别纯化rhMn-SOD 用pH8.0 的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液平衡，将DEAE纯化后活性部分上样，紫外检测收集并检测活性，将有活性部分合并，结果见图11及表2 图11 G-100分别纯化rhMn-S

20、OD的结果 如表2所示，经过DEAE离子交换及G-100分子筛分别纯化处理后，总纯化倍数达到5倍。 表2DEAE 离子交换层析及G-100纯化rhMn-SOD表 图12 各个纯化步骤电泳鉴定图 3结论 鉴于rhMn-SOD良好的热稳定性，我试验室用热变性法替代了传统的硫酸铵分级沉淀蛋白等方法，削减了化学药品的运用，降低成本，操作简洁，有利于大规模生产。 通过DEAE离子交换层析方法，选择合适的上样液及洗脱液，再通过G100进行分子筛处理纯化后，rhMn-SOD比活达到4411.706 U/mg，纯化倍数是粗酶液的5倍。 参考文献 1Bowler C, Carnp W V, Montgu M V

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