专题2-课题2-土壤中分解尿素细菌分离与计数-教案.docx

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1、专题2-课题2-土壤中分解尿素细菌分离与计数-教案专题 2 微生物的培育与应用课题 2土壤中分解尿素的细菌的分别与计数1、明确用培育基对微生物进行选择的原理。(重点) 2、学会统计微生物数量的方法。(重点) 3、能进行试验设计与操作，并对试验结果进行分析和评价。(难点) 一、筛选菌株的思路 1、自然界中目的菌株的筛选 （1）原理：依据对生存环境的要求，到相应的环境中去找寻。（2）实例：PCR 技术过程中用到的耐高温的 TaqDNA 聚合酶，就是从热泉中筛选出来的 Taq细菌中提取出来的。 DNA 多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量 DNA 大量复制的技术，此项技术要求运用耐高温(93)

2、的 DNA 聚合酶。1966 年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发觉了水生耐热细菌 Taq，从该细菌中分别得到了耐高温的 DNA 聚合酶。因为热泉温度 7080，淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的 Taq 细菌被筛选出来。2、试验室中目的菌株的筛选 （1）原理：人为供应有利于目的菌株生长的条件(包括养分、温度、pH 等)，同时抑制或阻挡其他微生物的生长。（2）方法：利用选择培育基分别。选择培育基：允许特定种类的微生物生长，同时阻挡或抑制其他种类微生物生长的培育基。（3）实例：以尿素作为唯一氮源的培育基可以分别出分解尿素的细菌，因为只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用其中的氮

3、元素； 加入青霉素可以分别出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培育基可以分别固氮微生物。石油是唯一碳源的培育基，可以分别能消退石油污染的微生物。将培育基放在高温环境中培育，分别耐高温的微生物。二、统计菌落数目1、常用方法：稀释涂布平板法。（1）原理：样品的稀释度足够高时，培育基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推想出样品中大约含有的活菌数 （2）计算公式：每克样品中的菌株数(C÷V)×M。C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。M：代表稀释倍数。（3）

4、留意事项 a为了保证结果精确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，并取平均值。b统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。缘由是当两个或多个细胞连在一起时，平板上视察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。c设置比照：主要目的是解除试验组中非测试因素对试验结果的影响，提高试验结果的可信度。设置比照的方法：空白比照：不给比照组任何处理因素；条件比照：给比照组施以部分试验因素，但不是所要探讨的处理因素；自身比照：比照组和试验组都在同一探讨对象上进行；相互比照：不单设比照组，而是几个试验组相互比照。教材实例分析：教材中两位同学的统计结果中，其次位同学

5、的结果接近真实值。试验须要改进的操作是第一位同学需设置重复试验组；其次位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新试验。教材供应的案例中 A 同学的结果与其他同学不同，可能的说明有两种。一是由于土样不同，二是由于培育基污染或操作失误。如何设置比照试验来确定缘由？ 方案一：其他同学用与 A 同学一样的土样进行试验，假如结果与 A 同学一样，则证明 A 操作无误；假如结果不同，则证明 A 同学存在操作失误或培育基的配制有问题。方案二：将 A 同学配制的培育基在不加土样的状况下进行培育，作为空白比照，以证明培育基是否受到污染。通过这个事例可以看出，试验结果要有劝服力，比照试验的设置是必不行少

6、的。2、利用显微镜干脆计数 (1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算肯定容积的样品中微生物的数量。(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为 1 mm2 和高为 0.1 mm 的计数室，在 1 mm2 的面积里又被划分成 25 个(或 16 个)中格，每个中格进一步划分成16 个(或 25 个)小格，但计数室都是由 400 个小格组成的。如下图所示。 (3)计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。(4)缺点：不能区分细菌的死活。3、干脆计数法与间接计数法的比较 微生

7、物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般运用计数法，计数法可分为干脆计数法和间接计数法。二者比较如下：干脆计数法 间接计数法 主要用具 显微镜、细菌计数板 培育基 计数依据 菌株本身 培育基上菌落数 优点 计数便利、操作简洁 计数的是活菌 缺点 死菌、活菌都计算在内 操作较困难，且有肯定误差 计算 公式 每毫升原液含菌株数400×1 0000×每小格平均菌株数×稀释倍数 每毫升原液含菌株数平均菌落数mL×稀释倍数三、试验设计与操作1、试验步骤 步骤 试验操作 操作提示 土壤 取样 从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样。先铲去表层土 3_

8、cm 左右，再取样，将样品装入事先打算好的信封中 取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌制备 培育基 分别配制牛肉膏蛋白胨培育基和尿素为唯一氮源的选择培育基 牛肉膏蛋白胨培育基可以作为比照，用来推断选择培育基是否起到了选择作用 样品 的稀 释和 涂布 称取 10 g 土样加到盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀； 吸取上清液 1 mL，转移至盛有 9_mL的生理盐水的无菌大试管中，根据上图流程进行样品的稀释； 根据由 107 10 3 稀释度的依次分别吸取 0.1 mL 进行平板涂布操作。根据浓度从低到高的依次涂布平板，不必更换移液管 应在火焰旁称取土样； 由于初次试验，对于稀释的范

9、围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围 103 10 7 倍的稀释液； 试验时要对所用的平板、试管作好标记。如培育皿要注明培育基类型、培育时间、稀释度、培育物等 培育 将涂布好的培育皿放在 3037 温度下培育。随着培育时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培育基和选择培育基中菌落的数量、形态等，并做好记录 在牛肉膏蛋白胨培育基上生长的菌落数目应明显多于选择培育基上的数目，才说明选择培育基有选择作用 计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，并依据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目 假如得到

10、了 2 个或 2 个以上菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操作比较胜利； 假如同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，须要重新试验； 在菌落计数时，每隔 24 h 统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培育时间不足而导致遗漏菌落的数目2、探讨 (1)为什么分别不同的微生物要采纳不同的稀释度？ 缘由：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就须要按不同的稀释度进行分别。稀释度微生物 细菌 放线菌 真菌 稀释度 104 、10 5 、10 6103 、10 4 、10 5102 、10 3 、10 4目的：保证获得菌落数在

11、30300 间的平板进行计数。(2)不同的微生物培育的温度和时间相同吗？ 培育不同微生物往往须要不同培育温度和培育时间。微生物 细菌 放线菌 霉菌 培育温度 3037 2528 2528 培育天数 12 d 57 d 34 d 3、菌种鉴定 （1）菌落特征是鉴定菌种的主要依据：包括菌落的形态、大小、隆起程度和颜色等。（2）鉴定原理：选择选择培育基中不同形态的菌落接入含酚红培育基的斜面中，由于细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培育基的碱性增加，pH 上升，使指示剂变色，菌落四周变红。（3）鉴别培育基：是指在培育基中加入某种特别的化学物质，某种微生物在培育基中生长后产生的某种代谢产物可以与该特别化

12、学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性改变，从而鉴别该微生物。如大肠杆菌在含有伊红美蓝的培育基中，菌落会出现黑色。4、分别尿素分解菌操作中的留意事项 (1)无菌操作：在试验操作中，每个步骤都要留意无菌操作，以防培育基被污染，影响试验效果。(2)做好标记 本试验运用的平板和试管比较多，为避开混淆，最好在运用前就做好标记。(3)规划时间 对于耗时较长的生物试验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。(4)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有 30300 个菌落。(5)设置比照 未接种的培育基作为空白比照，假如未接种的培育基中无菌落生长，说明培育基未被杂菌污染。反之，则被杂菌污染。 牛肉膏培育基上的菌落数目大于选择培育基上的数目，说明选择培育基具有选择作用。（6）平行重复原则。每个稀释度涂布 3-5 个平板作为试验重复，求其平均值。若其中菌落数差距悬殊，须要对该平板重新制作。(7)留意培育时间和温度，获得精确的菌落数。细菌：3037 ，培育 12 d；放线菌：2528 ，培育 57 d；霉菌(真菌)：一般在 2528 ，培育 34 d。(8)微生物的菌落特征包括菌落的形态、大小、隆起程度和颜色等方面。细致视察分别到的菌落，记录它们的特征。